辣椒细胞质雄性不育的生理机制和相关基因及标记的鉴定

【摘要】植物细胞质雄性不育（cytoplasmicmalesterility,CMS）是线粒基因组重组所引起的植物雄蕊败育现象。花粉产生是一个由遗传因子严格控制的复杂过程，尽管目前已发现辣椒（CapsicumannuumL.）细胞质雄性不育与线粒体异常开放阅读框orf507及突变的Ψatp6-2基因相关，但是其与线粒体呼吸代谢相关酶的关系，及其在植物细胞质雄性不育中所发挥的作用尚未见报道。此外，在某些可育胞质中也可观察到轻微的orf507基因与Ψatp6-2基因扩增产物出现，而且辣椒细胞质雄性不育存在多种败育特征，说明在辣椒不育系中还存在着其他不育相关基因。更为重要的是单一不育细胞质源的广泛应用存在巨大的潜在风险，因此开发新的细胞质雄性不育相关基因并鉴定其功能将为阐明辣椒细胞质雄性不育机理提供理论基础，并丰富细胞质雄性不育源，为农业生产提供便利。为此，本试验以辣椒细胞质雄性不育系HW203A及同核异质保持系HW203B为试验材料，首先对其花药进行了发育细胞学观察，以确定HW203A的败育特征，然后通过qRT-PCR技术对orf507基因与Ψatp6-2基因进行了表达模式分析，并利用VIGS技术及农杆菌介导的植物遗传转化技术对这两个基因进行了功能分析。在此基础上，以3套不同类型的辣椒细胞质雄性不育系及其保持系为材料，利用SRAP技术对其线粒体基因组进行了分析，以期开发新的CMS标记，并探讨细胞质雄性不育分子机理。研究主要结果如下：1.不育系HW203A花药败育发生在四分体时期以后，并伴随着细胞程序性死亡提前进行。orf507基因与Ψatp6-2基因在花药中的表达量均为最高，不育系orf507基因下调表达，保持系中不表达；不育系细胞色素c氧化酶活性在四分体时期达到最高，与保持系呈相反的变化趋势。随着花药发育，不育系Ψatp6-2基因呈下调表达，对应的F1Fo-ATPase水解活性逐渐降低，而保持系atp6-2基因则为上调表达，与花药发育初期之后急剧下降的F1Fo-ATPase水解活性变化趋势成反比。这些说明不育系HW203A线粒体细胞色素c氧化酶及F1Fo-ATPase存在功能障碍，并且与花药败育有着密切的关系。2.通过VIGS技术对保持系atp6-2基因及不育系Ψatp6-2基因功能进行了初步鉴定分析，结果表明保持系atp6-2基因沉默导致线粒体F1Fo-ATP合成酶水解活性增强，并引起了花粉败育；不育系中Ψatp6-2基因的沉默则抑制了F1Fo-ATP合成酶水解活性，并使得不育系育性得到了部分恢复。突变的ATP水解功能同样影响了基因沉默植株对外界非生物胁迫的耐性。对不育系及其保持系不同发育时期花药进行F1Fo-ATPase组织化学定位分析发现，ATP大量提前水解发生在不育系花药发育的四分体时期，但是在单核小孢子时期却没有观察到ATPase水解反应颗粒存在，这些结果说明Ψatp6-2基因的表达使得F1Fo-ATP合成酶ATP水解活性在花药发育过程中发生改变，并最终导致了辣椒细胞质雄性不育现象的发生。3.保持系与不育系花药细胞色素c氧化酶组织化学定位分析发现，不同发育时期绒毡层细胞及外围的绒毡层膜上细胞色素c氧化酶活性存在显著差异。为了进一步分析orf507基因在辣椒细胞质雄性不育中的作用，构建TCON植物表达载体，以烟草绒毡层特异表达启动子TA29启动子启动表达orf507基因，并通过coxIV转运肽转运至线粒体。与非转基因植株相比，转基因植株形态学基本无变化，但是结果量少，且其花药不饱满，呈黄化皱缩状态，基本不开裂，只能够产生少量花粉，但是花粉自然破损率高，萌发力低，呈部分不育特性；与不育系花药严重干瘪皱缩，不能产生花粉的败育特征存在差异。转基因植株花药四分体时期绒毡层细胞发生了细胞程序性死亡的提前进行，细胞消融，至单核小孢子时期，小孢子变形并降解。orf507基因的表达在一定程度上能够抑制保持系atp6-2基因的表达，且能增强花药线粒体细胞色素c氧化酶与F1Fo-ATP合成酶ATP水解活性。这些结果说明orf507基因的表达改变了花药绒毡层细胞中细胞色素c氧化酶及F1Fo-ATP合成酶ATP水解活性，导致线粒体能量紊乱，引起绒毡层细胞程序性死亡的提前进行，最终诱发了植株部分不育现象的发生。4.对3套不同类型的CMS系统的不育系与保持系线粒体基因组进行了SRAP（sequencerelatedamplificationofpolymorphism）分析以开发新的可靠的CMS特异标记。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳及Tail-PCR技术，发现了一个不育胞质特异的分子标记-SCAR130，其在不育系线粒体DNA中在SRAP引物位点结合处发生了10bp碱基缺失突变，使得在不育系中的扩增只能产生130bp的片段，而在保持系中扩增产物片段大小为140bp。S型胞质可以通过PCR扩增片段大小不同而准确简单的被筛选出来。将SCAR130、orf507、ψatp6-2和accD-U4个分子标记分别用于不同类型的辣椒品系中检测发现，SCAR130具有更可靠的稳定性。同源比对分析发现，这一标记位于烟草线粒体“trnE”和“trnS”基因之间。而且，SCAR130连锁基因表达模式分析结果显示其在不育系花药败育时期的表达量要显著高于保持系，这一结果表明SCAR130标记与辣椒细胞质雄性不育关系密切，因此，orf507及ψatp6-2基因之外的其他不育相关因子可能存在并参与了辣椒细胞质雄性不育的调控。
【作者】吉姣姣；
【导师】巩振辉；
【作者基本信息】西北农林科技大学，园艺植物种质资源学，2014，博士
【关键词】辣椒；细胞质雄性不育；orf507基因；Ψatp6-2基因；基因功能鉴定；

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