EGFR信号诱导PKM2/β-catenin核转位促进原发性肝癌根治性切除术后早期复发

【摘要】根治性切除是早期肝癌治疗最理想的手段,然而仍然有30-50%的患者预后较差,在诸多影响预后的因素中,早期复发又是其中最重要的因素之一。肝癌的早期复发是指根治性切除术后一年内出现肉眼可见的肝内或肝外转移灶,而且这种转移灶的恶性程度较高,因此,预防早期复发是改善肝癌根治性切除术患者预后最关键的途径。然而,一方面,临床上尚无准确预测肝癌根治性切除后早期复发的指标,另一方面,肝癌根治性切除术后早期复发(EarlyRecurrenceofHCCafterRadicalResection,ERHRR)的分子机制不明,因此,寻找准确预测早期复发的指标和揭示早期复发的分子机制迫在眉睫。肝癌根治性切除后早期复发主要是癌细胞肝内或肝外转移扩散的结果,本课题组对肝癌的转移机制进行了大量的研究,发现相关生长因子控制的下游信号通路活化是肝癌恶变的一个重要标志。新近的临床研究表明EGFR信号在40-70%肝癌患者处于激活状态,然而其与ERHRR的关系尚不清楚。考虑到EGFR信号在肝癌发生发展中的重要作用,我们提出EGFR信号的激活可能是参与ERHRR的分子机制之一的科学假说。本论文首先探讨了EGFR信号与ERHRR的相关性。以免疫组织化学方法检测62例原发性肝癌根治性切除患者新鲜肝癌组织标本中p-EGFR水平,并用Kaplan-Meier分析p-EGFR的表达与早期复发的相关性。结果发现,58%的肝癌患者p-EGFR呈阳性表达,统计分析显示肝癌组织标本中p-EGFR的水平与根治性切除术后早期复发具有明显的相关性。体外实验研究发现,五种人肝癌细胞株中,HepG2和SMMC-7721中EGFR的表达最高,同样,二者对EGF刺激的反应也最敏感,EGF(100ng/ml)处理12h后,细胞即出现了明显的间质化形态,同时细胞迁移能力明显增加,提示活化EGFR信号诱导了肝癌细胞的上皮间质化。目前已明确,EMT是肝癌发生肝内转移必须经历的过程。因此,我们推测EGFR信号诱导的肝癌细胞EMT可能是导致ERHRR的重要机制之一。本论文接下来主要研究：①GFR信号诱发ERHRR的分子机制；②尝试寻找预测EGFR信号上调的ERHRR的可靠指标。体外机制研究,现已明确,多种生长因子(TGF-β,HGF)均可以诱导肝癌细胞EMT过程,有趣的是,β-catenin均在其中发挥关键的作用。本论文研究发现,EGF诱导的肝癌细胞EMT过程和运动迁移同样需要β-catenin的参与,进一步机理研究发现,β-catenin参与EGF诱导的肝癌细胞EMT和迁移是通过上调β-catenin-TCF/LEF转录活性,上调其靶基因Snail来实现的。进一步研究发现EGF诱导的肝癌细胞β-catenin-TCF/LEF转录活化不是Wnt信号通路依赖的,而是PI3K/AKT和ERK信号通路依赖的,深入的研究发现,在EGF诱导的β-catenin-TCF/LEF转录激活的过程中,PDK/AKT调控β-catenin入核,而ERK调控PKM2入核,两者共同调控TCF/LEF的转录活性。为了进一步验证体外机制研究的结果,本论文对62例肝癌患者新鲜标本包括E-cadherin,Snail,β-catenin,PKM2相关指标的表达进行了检测,并采用了相关的统计方法进行了分析。相关性分析发现,p-EGFR的表达与Snail,核内PKM2,核内β-catenin的表达呈正相关,而与E-cadherin成负相关。同时还发现snail的表达水平与核内PKM2和β-catenin共同表达水平呈正相关,而E-cadherin的表达水平与核内PKM2和β-catenin共同表达水平呈负相关。另外,本论文还对E-cadherin,Snail及核内PKM2/β-catenin共表达水平与早期复发率进行了Kaplan-Meier分析。结果发现E-cadherin和Snai的表达水平与早期复发无明显的相关性,而核内PKM2/β-catenin共表达水平与早期复发呈现良好的相关性,p-EGFR阳性表达和核内PKM2/β-catenin阳性的患者具有最高的复发率68.64%。COX多因素分析也证实PKM2/β-catenin核内共表达是影响ERHRR独立的因素。PKM2/β-catenin共表达水平与早期复发呈现良好的相关性,而其下游指标Snail和E-cadherin的表达水平与早期复发却无明显的相关性。紧接着本论文又对这一似乎矛盾的结论进行了深入的研究。结果发现,EGFR信号不仅诱导肝癌细胞侵袭,还对肝癌细胞的增殖产生影响。有趣的是,EGFR信号对肝癌细胞增殖的影响与EGFR活化的时间相关,短时间(24h以内)活化EGFR信号抑制SMMC-7721和HepG2的增殖,机制与细胞周期阻止相关;长时间(72h)活化EGFR信号明显促进SMMC-7721和HepG2的增殖,其机制与上调C-myc和CyclinD1表达有关。体内EGFR信号是处于持续性活化状态,临床标本分析也证实,Ki-67的表达不仅与p-EGFR的表达呈正相关,还与PKM2/β-catenin核共表达呈正相关。复发分析发现E-cadherin(-)/Ki-67(+)的肝癌根治性切除患者具有很高的复发率。综上,EGFR信号持续的激活促进肝癌细胞侵袭和增殖导致肝癌根治性切除患者的早期复发。本论文通过体内和体外的研究确证了EGFR信号在根治性切除肝癌患者术后早期复发中的作用,并阐明了其分子机制,为EGFR信号活化的肝癌根治性切除患者的早期复发提供了可靠的预测指标和防治的治疗策略。更重要的是,本论文是课题组“国家自然自然基金”和“博士点基金”项目中的部分研究内容,为含丹参类中药复方预防ERHRR的研究提供了医学分子生物学基础,推动了传统中医药在肝病防治中的应用。
【作者】范方田；
【导师】陆茵；
【作者基本信息】南京中医药大学，中药药理学，2014，博士
【关键词】肝癌；根治性切除术；早期复发；EMT；EGFR信号；侵袭迁移；PKM2；β-catenin；

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