Wiskott-Aldrich综合征和DOCK8免疫缺陷综合征T细胞受体多样性研究

【摘要】第一、二部分Wiskott-Aldrich综合征T细胞受体多样性研究背景：湿疹，血小板减少伴免疫缺陷综合征（Wiskott-Aldrichsyndrome，WAS，OMIM301000)是一种以血小板减少、湿疹、免疫缺陷、易患自身免疫疾病和淋巴系统恶性肿瘤为特征的原发性免疫缺陷疾病。WAS的发病率约为1-10/1，000，000新生男婴。该疾病系由位于X染色体上的WAS基因突变所致。WAS基因编码WAS蛋白（WASprotein，WASp)，WASp是一种造血系统特异的肌动蛋白核调节蛋白，接受细胞膜表面的信号分子激活。若不经治疗，WAS患者的平均寿命为15岁。由于WASp表达于除红细胞以外的所有的造血系统细胞，WAS突变广泛影响多种免疫细胞功能。然而，由于T细胞缺陷被认为是WAS病人免疫缺陷的核心问题，WAS基因突变是否会不同程度影响不同T细胞亚群的T细胞受体（Tcellreceptor,TCR）多样性尚属未知。目的：研究WAS病人不同T细胞亚群T细胞受体β链可变区（TCRβCR体体variablegene,TCRVβ）受体谱限制性改变的程度及模式。方法：收集23例年龄在2月-22岁的WAS患者及25例同龄正常对照儿童新鲜外周血标本，分离单个核细胞（Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC），采用流式细胞术分选CD4+、CD8+T细胞，进一步分选足够数量的初始及记忆CD4+、CD8+T细胞，从总的外周血及分选的各群细胞中立即提取RNA，并合成cDNA。1.采用互补决定区3扫描谱型分析方法（CDR3spectratyping）分析比较WAS及同龄正常对照儿童CDR3谱型变化，为明确各亚家族多样性受限情况，我们对各CDR3谱型图进行复杂性评分，评分小于4分的亚家族即为TCRVΒ多样性受限；对总的外周血细胞及分选的各群细胞的平均复杂性评分、受限频率进行统计学分析。2.采用高通量测序(Highthroughputsequencing,HTS)方法，对12例WAS患者和12例同龄正常对分选所得的初始CD4+、CD8，记忆CD4+T细胞的CDR3区域进行深度测序，运用辛普森指数(Simpsonindex,Ds)和香浓威纳指数(ShannonWeinerindex,H’)评估各群T细胞的TCR多样性，用生物信息学方法分析不同样品间共有和特异的TCRCDR3序列。结果：1.运用CDR3扫描谱型分析方法，我们研究了7例WAS患儿（P1-P7）和同龄对照外周总T细胞TCR多样性，结果发现对照组的TCRCDR3谱型图多表现为6个以上的呈钟形分布的峰图，提示其为多克隆表达；而WAS病人众多亚家族的峰图表现为峰数减少，呈非钟形分布的受限峰图，提示其T细胞呈单克隆或寡克隆扩增（图1.3A）。为量化评估TCR受限程度，我们对每个研究对象的23个亚家族均进行复杂分数评分，结果发现病人组的平均复杂分数显著低于对照组的平均复杂分数（图1.3B）。2.为明确病人TCR多样性受限来源，我们将6例病人和对照的外周血进行分选，得到高纯度的CD4+和CD8+T细胞，运用CDR3扫描谱型分析方法评估各亚群的TCR多样性受限情况。结果发现，病人CD4+T细胞的多数亚家族的峰图呈钟形分布，而CD8+T细胞多数亚家族的峰图呈受限表现（图1.5A）。与同龄对照相比，病人组的CD4+，CD8+T细胞的平均复杂分数均显著降低，这提示WAS病人的CD4+，CD8+T细胞TCR多样性均明显受限（(CD4,P=.002;CD8,P=.002；图1.5B）。3.为进一步明确WAS病人TCR多样性受限来源，我们分选得到了分别来自12例WAS病人和同龄对照的高纯度的初始和记忆CD4+，CD8+T细胞亚群，并运用CDR3扫描谱型分析方法评估各个亚群的TCR受限情况。研究发现，同龄对照组的初始CD4+,初始CD8+,记忆CD4+T细胞亚群多数亚家族的峰图呈钟形分布，而记忆CD8+T细胞多数亚家族的峰图则是受限表现；而在WAS病人组，只有初始CD4+T细胞多数亚家族的TCR峰图呈钟形分布，而初始CD8+，记忆CD4+，记忆CD8+TCR峰图均受限（图1.6A）。与同龄对照相比，病人组的记忆CD4+，初始CD4+，初始CD8+T细胞的平均复杂分数均显著降低，这提示WAS病人的记忆CD4+，初始CD4+，初始CD8+T细胞TCR多样性均受限（图1.6B）。4.我们对WAS病人和同龄对照的23个亚家族的受限频率进行分析，结果发现在外周总T细胞中，WAS病人组的受限频率中位数是17.39%（0-47.83%），对照组为4.35%（0-17.39%），两组没有统计学差异。而由于外周总T细胞由多群细胞构成，不同细胞亚群的受限程度的不同可能掩饰总的受限情况。因此，我们对不同T细胞亚群的受限频率进行分析，结果发现病人组CD4+T,CD8+T细胞亚群的受限频率均显著低于同龄对照组这两个细胞亚群的受限频率(CD4+T,P=.03；CD8+T细胞，P=.01)。为明确初始和记忆T细胞亚群与TCR受限的关系，我们进一步分析了初始和记忆CD4+，CD8+T细胞亚群的受限频率。研究发现，跟同龄对照相比，病人组的初始CD8+T细胞和记忆CD4+T细胞的受限频率均显著高于同龄对照组（见图1.7）。该结果进一步证实WAS病人的初始CD8+T细胞和记忆CD4+T细胞亚群的TCR多样性是显著受限的。5.运用高通量测序方法，对WAS病人及同龄对照分选的初始CD4+、CD8，记忆CD4+T细胞的CDR3区域进行深度测序发现，WAS患者和同龄对照间不同细胞亚群的测序读数和CDR3氨基酸序列数没有统计学差异。然而，病人组的记忆CD4+T细胞亚群的有效读数，初始CD8+T细胞亚群独特的肽段读数均显著低于同龄对照组。病人组的三个细胞亚群的Ds和H’均低于对照组，这表明病人组的TCR多样性低于同龄对照组；然而，跟同龄对照组相比，WAS病人的细胞亚群中只有记忆CD4+T和初始CD8+T细胞亚群的H’显著低于同龄对照组(P=.003，P=.022；图2.1A)。结论：在国内外首次发现WAS基因突变可选择性影响初始CD8+T细胞及记忆CD4+T细胞TCRVΒ库多样性的形成，可能与WAS病人对疫苗、感染的记忆应答减低有关。第三部分DOCK8免疫缺陷综合征T细胞受体多样性研究背景：DOCK8免疫缺陷综合症（Dedicatorofcytokinesis8immunodeficiencysyndrome，DIDS；OMIM243700)是一种以皮肤病毒感染，过敏，易患肿瘤，淋巴细胞减少症，IgE增多，嗜酸细胞增多等为特征的联合免疫缺陷疾病。该疾病是由9号染色体上的DOCK8基因突变导致。DOCK8基因编码DOCK8蛋白，属于DOCK180蛋白超家族，为一种新的针对Rho家族GTP酶的鸟嘌呤核苷转录因子(guaninenucleotideexchangefactor,GEF)，DOCK180-相关的鸟嘌呤核苷酸转录因子在多种细胞表面受体的下游起作用，诱发肌动蛋白细胞骨架重排，板状伪足形成，细胞迁移，整合蛋白介导的粘附、吞噬、细胞融合、细胞极化、以及突触形成等生物学过程。DIDS死亡率较高，在报道的32例已确诊病人中，7例在6-21岁间死亡。由于DOCK8蛋白表达于全身多个脏器和组织，因此DOCK8突变对机体的影响广泛。DIDS病人可表现出多种免疫系统异常。其中最显著的发现为淋巴细胞减少症和抗体异常。DIDS本质上为联合免疫缺陷，患者反复罹患病毒感染与T细胞功能缺陷关系密切，足够丰富的T细胞库为机体针对数量巨大的病原体感染提供物质基础。然而，与WASp同属细胞骨架重构过程中的重要分子，DOCK8基因突变是否也会选择性影响不同T细胞亚群的TCR多样性尚未明确。目的：研究DIDS外周血总T细胞，分选的CD4+、CD8+T细胞，分选的初始和记忆CD4+、CD8+T细胞受体β链可变区（TCRVβ）受体谱限制性改变的程度及模式。方法：收集4例DIDS患儿及6例同龄正常对照新鲜外周血标本，分离单个核细胞（PBMC），采用流式细胞术分选CD4+、CD8+T细胞，进一步分选足够数量的初始及记忆CD4+、CD8+T细胞，从总的外周血及分选的各群细胞中立即提取RNA，并合成cDNA。1.采用互补决定区3扫描谱型分析方法分析比较DIDS患儿及同龄正常对照CDR3谱型变化，对各CDR3谱型图进行复杂性评分，评分小于4分的亚家族即为TCRVΒ多样性受限；对总的外周血细胞及分选的各群细胞的平均复杂性评分、受限频率进行统计学分析。2.采用HTS方法，对2例DIDS患儿两次分选的多个T细胞亚群与12例WAS患儿，和12例同龄正常对照分选所得的初始CD4+、CD8，记忆CD4+T细胞的CDR3区域进行深度测序，运用Ds、H’和D50评估各群T细胞的TCR多样性。结果：与年龄匹配的正常对照相比，1.在总的外周血细胞中，4例DIDS患儿的TCRVΒ多样性较之6例正常对照有明显受限，受限频率有显著统计学差异（P=.01;见图3.1C）。2.对2例DIDS患儿分选的CD4+,CD8+T细胞，以及初始、记忆CD4+和CD8+T细胞的TCR多样性分析发现，结果发现DIDS患者的CD4+T细胞，初始CD4+和记忆CD4+T细胞的CDR3谱型图多表现为6个以上的呈钟形分布的峰图，提示其为多克隆表达；而DIDS患者的CD8+T细胞，初始CD8+和记忆CD8+T细胞的许多亚家族谱型图表现为峰数减少，呈非钟形分布的受限峰图，提示其T细胞呈单克隆或寡克隆扩增（图3.2A）。对各亚家族计算其平均复杂性分数，在P3，P4，DIDS病人的初始及记忆CD8+T细胞的平均复杂分数显著低于其初始和记忆CD4+T细胞的平均复杂分数（图3.2B）。DIDS病人的初始CD4、记忆CD4和初始CD8T细胞亚群的平均复杂分数和受限频率与正常对照组及WAS病人相比，仅有初始CD8T细胞亚群的平均复杂分数显著低于正常对照，受限频率显著高于正常对照（P<.001，P<.001，图3.2,C，D），其余亚群无显著统计学差异。这证实了DOCK8基因突变主要导致初始CD8+T细胞的TCR多样性受限。3.运用高通量测序方法，对2例DIDS患儿总T细胞，分选的CD4+、CD8，初始和记忆CD4+、CD8+T细胞的CDR3区域进行深度测序发现，DIDS患者的总测序读数和有效读数在各细胞亚群间无明显差异，而CD8+、初始CD8+、记忆CD8+T细胞亚群的总的克隆数、特异肽段数和D50明显低于CD4+、初始CD4+、记忆CD4+T细胞（图3.3），这提示DIDS病人的CD8+、初始CD8+、记忆CD8+T细胞TCR多样性受限。4.研究发现DIDS病人组的三个细胞亚群的H’、Ds和D50均低于对照组（图3.4），这表明DIDS病人的TCR多样性低于同龄对照组。跟同龄对照组相比，DIDS病人的细胞亚群中初始CD8+T细胞亚群的H’和D50均显著低于同龄对照组(P<.0001，P=.03；图3.4)，其他亚群无统计学差异。提示DIDS病人的初始CD8+T细胞亚群的TCR多样性显著减低。与WAS病人相比，DIDS病人仅有初始CD8+T细胞的H’、Ds和D50减低，而初始CD4和记忆CD4T细胞亚群的H’、Ds和D50都高于WAS病人，这提示DIDS病人的初始CD8+T细胞TCR多样性受限程度比WAS受限程度严重。5.运用高通量测序方法，对1例DIDS患儿（P3）第二次随访的总PBMC，分选的CD3、CD4+、CD8+、初始和记忆CD4+、CD8+T细胞的CDR3区域进行深度测序发现，DIDS患者的总测序读数和有效读数在各细胞亚群间无明显差异，而总PBMC、CD3+T细胞的总的克隆数、特异肽段数和D50，均显著低于CD4+、初始CD4+、记忆CD4+T细胞（图3.5）。这提示分亚群研究TCR多样性受限能更准确反映个体TCR多样性情况。结论：在国内外首次发现DOCK8基因突变可选择性影响初始和记忆CD8+T细胞TCRVΒ库多样性形成，可能与DIDS患者对感染的应答减低有关。研究证实对个体TCR多样性的研究，分亚群研究更能准确反映机体TCR多样性情况。
【作者】吴俊峰；
【导师】赵晓东；
【作者基本信息】重庆医科大学，儿科学，2014，博士
【关键词】Wiskott-Aldrich；综合征；TCR多样性；CDR3扫描谱型分析方法；高通量测序；DOCK8免疫缺陷综合征；

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