氧糖剥夺/再灌注星形胶质细胞HMGB1对神经干细胞增殖的影响及机制研究

【摘要】脑血管病为临床常见病、多发病，致死率、致残率高，对人类健康产生严重危害。其中缺血性脑血管病又占绝大多数，而脑缺血/再灌注造成的神经元损伤又是导致神经功能缺损的主要原因，因此促进脑缺血/再灌注损伤后的神经再生对其治疗有重要意义。近年来大量的研究发现，脑缺血/再灌注损伤后损伤的局部会出现神经干细胞的自发增殖，但导致其自发增殖的原因尚未明确。研究表明脑缺血损伤的局部常常伴随星形胶质细胞的反应性增殖，而作为神经再生微环境的重要组成部分星形胶质细胞，对神经干细胞再生的调控有重要作用。目前已证实：脑缺血/再灌注损伤后星形胶质细胞可以通过释放高迁移率族蛋白B1（high-mobilitygroupbox1，HMGB1）促进血管内皮细胞的增殖及神经血管单元的修复；而在生理状态下，HMGB1可以促进神经干细胞的增殖和脑的发育，但在脑缺血/再灌注后星形胶质细胞是否通过释放HMGB1来促进神经干细胞的增殖目前尚未见报道。本研究包括三部分：①通过建立体外氧糖剥夺/再灌注星形胶质细胞模型模拟脑缺血/再灌注的病理过程，确定氧糖剥夺/再灌注星形胶质细胞是否可以表达和释放HMGB1；并采用RNA干扰技术沉默氧糖剥夺/再灌注星形胶质细胞HMGB1的表达和释放；②通过对比含/不含HMGB1的星形胶质细胞条件培养基及外源性HMGB1对神经干细胞增殖的影响，明确HMGB1在神经干细胞增殖过程中的作用；③通过体外实验研究HMGB1促进神经干细胞增殖的过程是否与RAGE介导的JNK和PI3K/Akt通路的激活有关。第一章氧糖剥夺/再灌注对星形胶质细胞HMGB1表达的影响及RNA干扰对HMGB1表达的沉默作用目的：通过建立体外氧糖剥夺/再灌注(oxygenglucosedeprivation/reperfusion，OGD/R)星形胶质细胞模型，明确OGD/R是否可以促进星形胶质细胞表达和释放HMGB1。并观察携带HMGB1shRNA的慢病毒载体介导的RNA干扰技术是否可以有效沉默氧糖剥夺/再灌注星形胶质细胞HMGB1的表达。方法：体外培养新生24h内SD大鼠原代星形胶质细胞，通过慢病毒介导的RNA干扰技术沉默星形胶质细胞HMGB1基因后进行实验。将星形胶质细胞分为四组：正常组、OGD/R组、HMGB1shRNAOGD/R组、对照shRNAOGD/R组。采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测星形胶质细胞条件培养基（Astrocyte-conditionedmedium,ACM）内HMGB1的蛋白表达水平；采用WesternBlot方法和免疫荧光双标方法检测星形胶质细胞内HMGB1的蛋白表达。结果：①ELISA结果显示：与正常ACM比较，OGD/RACM中HMGB1表达水平明显升高（P＜0.001）；与OGD/RACM比较，HMGB1shRNAOGD/RACM内HMGB1表达水平明显降低（P＜0.001），而对照shRNAOGD/RACM内HMGB1表达水平明无明显差别（P＞0.05）。②WesternBlot结果显示：与正常组比较，OGD/R组星形胶质细胞内HMGB1表达水平明显升高（P＜0.001）；与OGD/R组比较，HMGB1shRNAOGD/R组星形胶质细胞内HMGB1表达水平明显降低（P＜0.001），而对照shRNAOGD/R组星形胶质细胞内HMGB1表达水平明无明显差别（P＞0.05）。③免疫荧光双标结果显示：正常组星形胶质细胞HMGB1仅表达与细胞核内；OGD/R组和对照shRNAOGD/R组星形胶质细胞内HMGB1广泛表达于整个细胞；而HMGB1shRNAOGD/R组星形胶质细胞内HMGB1的表达在胞核和胞浆中均明显减弱。结论：OGD/R可以刺激星形胶质细胞表达和释放HMGB1；而慢病毒介导的RNA干扰可以有效的沉默OGD/R星形胶质细胞内HMGB1的表达和释放。第二章氧糖剥夺/再灌注星形胶质细胞释放HMGB1对神经干细胞增殖的影响目的：通过体外实验观察OGD/R星形胶质细胞释放的HMGB1对神经干细胞增殖的影响。方法：将体外培养新生24h内SD大鼠原代神经干细胞分为六组：正常对照组、正常ACM组、OGD/RACM组、HMGB1shRNAOGD/RACM组、对照shRNAOGD/RACM组、HMGB1组（在正常对照培养基中加入10ng/ml的外源性HMGB1）。分别培养24h、48h、72h、96h后通过CCK-8增殖实验和流式细胞检测增殖指数的方法测定神经干细胞的增殖情况。结果：培养24h和48h后各组细胞间的CCK-8吸光度值和增殖指数无明显差异（P＞0.05）；培养72h和96h后，与正常对照组比较，OGD/RACM组、对照shRNAOGD/RACM组、HMGB1组细胞的CCK-8吸光度值和增殖指数均明显增加（P＜0.05）；而与OGD/RACM组比较，HMGB1shRNAOGD/RACM组细胞的CCK-8吸光度值和增殖指数均明显减少（P＜0.05）。结论：OGD/R星形胶质细胞可以通过释放HMGB1促进神经干细胞的增殖。第三章HMGB1促进神经干细胞增殖的作用机制目的：通过体外实验观察HMGB1促进神经干细胞增殖是否与晚期糖基化终末产物受体（receptorforadvancedglycationendproducts,RAGE）介导的JNK和PI3K/Akt通路的活化有关。方法：本实验由三部分构成：①RAGE受体通路实验：根据HMGB1培养基中是否添加RAGE中和抗体将细胞分为两组：IgG组和anti-RAGE组；②JNK信号通路实验：根据HMGB1培养基中添加JNK信号通路抑制剂SP600125浓度的不同将细胞分为四组：正常对照组、0μM组、1μM组、10μM组；③PI3K/Akt信号通路实验：根据HMGB1培养基中添加PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002浓度的不同将细胞分为四组：正常对照组、0μM组、1μM组、10μM组。培养96h后，通过CCK-8增殖实验检测神经干细胞的增殖情况，通过WesternBlot实验检测细胞内JNK和PI3K/Akt通路的磷酸化水平。结果：①RAGE受体通路实验：培养96h后，与IgG组相比，anti-RAGE组神经干细胞CCK-8吸光度值明显降低，同时伴有细胞内p-JNK和p-Akt蛋白表达水平下降（P＜0.001）；②JNK信号通路实验：培养96h后，与正常对照组相比，0μM组神经干细胞内p-JNK的蛋白表达水平升高的同时伴有细胞CCK-8吸光度值的明显升高（P＜0.001）；与0μM组比较，1μM组p-JNK的蛋白表达水平无明显变化而细胞CCK-8吸光度值也无明显差别（P＞0.05），而10μM组在抑制p-JNK的蛋白表达的同时细胞CCK-8吸光度值也明显降低（P＜0.001）；③PI3K/Akt信号通路实验：培养96h后，与正常对照组相比，0μM组神经干细胞内p-Akt蛋白的表达水平升高的同时伴有细胞CCK-8吸光度值的明显升高（P＜0.001）；与0μM组比较，1μM组p-Akt蛋白的表达水平无明显变化（P＞0.05），而细胞CCK-8吸光度值也无明显差别（P＞0.05），而10μM组在抑制p-Akt蛋白表达的同时细胞CCK-8吸光度值也明显降低（P＜0.001）。结论：HMGB1促进神经干细胞增殖的过程是通过作用于RAGE受体，并进一步使JNK和PI3K/Akt通路活化来发挥作用的。
【作者】李满；
【导师】罗勇；
【作者基本信息】重庆医科大学，神经病学，2014，博士
【关键词】氧糖剥夺/再灌注；星形胶质细胞；HMGB1；神经干细胞；增殖；RAGE；JNK；PI3K/Akt；RNA干扰；

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