盐酸右美托咪定预处理对大鼠肠缺血再灌注后肺损伤的作用及机制研究

【摘要】研究目的1.观察盐酸右美托咪定预处理对大鼠肠缺血再灌注后肺损伤的作用及对炎性因子的影响；2.研究盐酸右美托咪定预处理是否通过α2受体在大鼠肠缺血再灌注后急性肺损伤中发挥作用,为盐酸右美托咪定预处理在临床中的使用提供新的实验和理论基础。3.探讨TLR4/MyD88和PI3K/Akt信号通路在盐酸右美托咪定预处理对大鼠肠缺血再灌注后急性肺损伤影响中的作用,了解盐酸右美托咪定作用的分子生物学机制。研究方法1.盐酸右美托咪定预处理对大鼠肠缺血再灌注后急性肺损伤的作用研究。建立在体大鼠肠缺血再灌注模型,以血气分析、肺湿干重比值、肺组织病理变化、支气管肺泡灌洗液炎性因子变化为指标探讨不同剂量盐酸右美托咪定预处理对大鼠肠I/R后急性肺损伤的作用。健康雄性大鼠48只,随机分为4组：假手术组(Sham)、肠缺血再灌注组(IR)、盐酸右美托咪定2.5ug/(kg-h)预处理组.(DL)、盐酸右美托咪定5ug/(kg-h)预处理组(DH)。Sham组只开腹不阻断小肠肠系膜上动脉,IR组尾静脉以1.5ml/h速度输注生理盐水1小时后用无创血管夹阻断肠系膜上动脉1h,然后开放无创血管夹再灌注2h。盐酸右美托咪定预处理组(DL、DH)于小肠缺血前分别以2.5ug/(kg·h)和5ug/(kg·h)输注速度尾静脉持续输注1小时盐酸右美托咪定。肠缺血再灌注期间,所有实验大鼠尾静脉以1.5m1/h速度输注生理盐水至再灌注结束。实验结束后,左室抽血测定动脉血气,右室放血处死实验动物。然后,每组随机取6只大鼠进行主支气管灌洗,ELISA测定支气管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6浓度变化；每组其余6只结扎切取右中肺测定湿干重比值,并用30m1冷生理盐水灌肺,取右肺上叶以4%多聚甲醛固定做HE切片进行病理检查。2.α2肾上腺素受体在盐酸右美托咪定预处理对大鼠肠缺血再灌注后急性肺损伤影响中作用。健康雄性大鼠48只,随机分为4组：肠缺血再灌注(R)组、盐酸右美托咪定预处理(DH)组、盐酸育亨宾+盐酸右美托咪定预处理(YD)组、盐酸育亨宾预处理(Y)组。IR组尾静脉以1.5ml/h速度持续输注生理盐水1小时后用无创血管夹阻断肠系膜上动脉1h,然后开放无创血管夹再灌注2h。DH组于小肠缺血前以5ug/(kg·h)速度尾静脉持续输注盐酸右美托咪定1小时。YD组于小肠缺血前尾静脉缓慢注射盐酸育亨宾1mg/kg(大于15min),然后以5ug/(kg·h)速度持续输注盐酸右美托咪定1h。Y组于小肠缺血前尾静脉缓慢注射盐酸育亨宾1mg/kg(大于15min),然后以1.5m1/h速度持续输注生理盐水1小时。肠缺血再灌注期间,所有实验大鼠尾静脉以1.5ml/h速度输注生理盐水至再灌注结束。实验结束后,左室抽血测定动脉血气,右室放血处死实验动物。检测指标及方法同第一部分。3.TLR4/MyD88/NF-κB和PI3K/Akt信号通路在大鼠肠缺血再灌注肺损伤中的作用。健康雄性大鼠36只,随机分为6组：假手术组(Sham)、肠缺血再灌注组(IR)、盐酸右美托咪定2.5ug/(kg·h)预处理组(DL)、盐酸右美托咪定5ug/(kg·h)预处理组(DH)、盐酸育亨宾+盐酸右美托咪定预处理(YD)组、盐酸育亨宾预处理(Y)组。给药方法同第一、二部分,并建立大鼠肠缺血再灌注模型。实验结束后,右室放血处死实验动物,取部分肺组织以荧光实时定量PCR测定TLR4mRNA和MyD88mRNA的表达,Westernblotting测定IκBα、磷酸化IκBα、Akt和磷酸化Akt蛋白表达。研究结果1.假手术(Sham)组、肠缺血再灌注(IR)组、不同剂量盐酸右美托咪定预处理(DL、DH)组,于再灌注后组间比较动脉血气(pHa、PaO2、PaCO2),结果差异无统计学意义(P>0.05)。HE病理结果显示,Sham组肺组织结构正常,肺泡腔内见少量渗出,毛细血管未见明显充血和(或)出血；IR组肠缺血再灌注造成明显肺损伤,肺泡结构破坏明显,肺泡壁明显增厚,肺间质和肺泡出血水肿并有大量炎性细胞浸润；DL和DH组肺组织病理改变均较IR组明显减轻,肺间质和肺泡腔内渗出明显减少,但仍见有部分肺泡结构存在一定程度破坏,部分肺泡间隔略增厚,少量炎性细胞浸润。各组肺组织病理评分结果和病理切片HE染色结果趋势具有一致性,DL、DH组与IR组比较,病理评分和肺湿干重比值均明显降低(P<0.05)。DL和DH组支气管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6浓度明显比IR组降低(P<0.01)。DH组与DL组比较,不仅病理评分和肺湿干重比值进一步降低,支气管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-6浓度也进一步降低(P<0.01)。2.肠缺血再灌注(IR)组、盐酸右美托咪定预处理(DH)组、盐酸育亨宾十盐酸右美托咪定预处理(YD)组、盐酸育亨宾预处理(Y)组间比较动脉血气(pHa、PaO2、PaCO2)结果无统计学差异(P>0.05)。肺湿干重比较,DH和YD组与IR组比较,明显降低(p<0.05),YD组肺湿干重比值明显高于DH组(P<0.01),而Y组与IR组的肺湿干重比值比较无明显差异(P>0.05)。HE病理切片显示,IR组和Y组具有明显肺损伤,肺泡结构破坏明显,肺泡壁明显增厚,肺间质和肺泡出血水肿并有大量炎性细胞浸润;DH组肺组织病理改变均较IR组明显减轻。YD组肺组织具有中度的损伤,肺泡结构破坏明显,肺泡壁增厚,部分肺间质和肺泡出血水肿并有炎性细胞浸润。各组肺组织病理评分比较,DH和YD组与IR组比较,均明显降低(P<0.01)；YD组明显高于DH组(P<0.01),而Y组和IR组无明显差异(P>0.05)。支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎性因子的测定结果显示,与IR组比较,DH和YD组BALF中TNF-α和IL-6浓度明显降低(P<0.01)；与DH组比较,YD组TNF-α和IL-6浓度明显升高(P<0.01)。Y组与IR组比较,BALF中TNF-α和IL-6浓度无统计学差异(P>0.05)。3.免疫荧光定量PCR和蛋白印迹结果显示,IR组肺组织的TLR4mRNA、MyD88mRNA、磷酸化IκBα较Sham组表达明显增加(P<0.01),而IR组Akt的磷酸化与Sham组比较差异无统计学意义(P>0.05)。盐酸右美托咪定预处理(DL、DH)组、盐酸育亨宾+盐酸右美托咪定预处理(YD)组与IR组比较肺组织TLR4、MyD88mRNA、磷酸化IκBα表达均减少(P<0.01),磷酸化Akt增加(P<0.01)；与DH组比较,YD和DL组肺组织TLR4、MyD88mRNA、磷酸化IκBα表达均增加(P<0.01),磷酸化Akt减少(P<0.01)；而Y组与YD组比较肺组织TLR4、MyD88mRNA、磷酸化IκBα表达增加(P<0.01),磷酸化Akt减少(P<0.01)。单纯盐酸育亨宾预处理组,肠缺血再灌注后肺组织的TLR4mRNA.MyD88mRNA表达、磷酸化IKBa及Akt的磷酸化与IR组差异无统计学意义(P>0.05)。实验结论1.盐酸右美托咪定预处理能改善肠缺血再灌注造成的急性肺损伤和炎症反应,这种保护作用可能具有剂量依赖性。2.盐酸右美托咪定可能部分通过α2肾上腺素受体发挥对肠缺血再灌注后肺组织的保护和抗炎作用。3.TLR4/MyD88/NF-κB和PI3K/Akt信号通路均可能参与了盐酸右美托咪定预处理对肠缺血再灌注的肺保护作用,作用可能通过a2肾上腺素受体和非α2肾上腺素受体途径发挥。
【作者】沈金美；
【导师】徐军美；
【作者基本信息】中南大学，麻醉学，2013，博士
【关键词】盐酸右美托咪定；预处理；肠缺血再灌注；肺损伤；

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