miR-148a调控破骨细胞分化及其在SLE患者骨量异常中的作用机制

miR-148a调控破骨细胞分化及其在SLE患者骨量异常中的作用机制

作者:师大云端图书馆 时间:2015-07-27 分类:期刊论文 喜欢:1678
师大云端图书馆

【摘要】第一部分初发系统性红斑狼疮(SLE)患者破骨前体细胞hsa-miR-148a表达水平和意义目的:分离纯化初发SLE患者和正常对照组的CD14+外周血单核细胞(PeripheralBloodMononuclearCells,PBMCs),研究SLE患者CD14+PBMCshsa-miR-148a表达改变。探讨hsa-miR-148a表达与初发SLE患者骨量异常的关系。方法:招募相互匹配的31例中国青年女性,其中16人为未接受过糖皮质激素治疗的初发SLE患者,15例为正常对照组。用密度梯度离心法分离两组人群的外周血单核细胞,然后用免疫磁珠法分选高纯度的CD14+PBMCs,并通过实时定量PCR(real-timequantitativePCR,qRT-PCR)法检测hsa-miR-148a在两组人群CD14+PBMCs中的表达情况。在上述两组人群的CD14+PBMCs使用重组人巨噬细胞集落刺激因子(recombinanthuman-macrophagecolonystimulatingfactor,rh-MCSF)和人核因子κB受体活化素配体(humanreceptoractivatorofnuclearfactor-KBligand,hRANKL)诱导其向破骨细胞分化,行抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistantacidphosphatase,TRAP)染色、‘TRAP活性测定及实时定量PCR法检测破骨细胞分化指标TRAP/活化T细胞核因子c1(nuclearfactorofactivatedTcellsc1,NFATc1)mRNA水平观察两组破骨细胞的分化成熟情况。将anti-miR-148a转染SLE患者的CD14+PBMCs,转染后加入rh-MCSF和hRANKL诱导破骨细胞分化培养,行TRAP染色、TRAP活性测定及实时定量PCR法检测TRAP/NFATclmRNA水平观察破骨细胞的分化成熟情况。结果:(1)初发SLE患者的骨密度明显低于正常对照组,而初发SLE患者CD14+PBMCs中的hsa-miR-148a表达水平明显高于正常对照组。(2)与正常对照组相比,SLE患者组TRAP+多核巨细胞数量增加,TRAP活性增强,TRAP/NFATc1mRNA水平升高。(3)将anti-miR-148a转染SLE患者的CD14+PBMCs,可抑制TRAP+多核巨细胞形成,TRAP活性减弱,TRAP/NFATc1mRNA水平下降。结论:初发SLE患者CD14+PBMCs中的hsa-miR-148a表达明显升高,导致其破骨活性增强,骨量降低。第二部分mmu-miR-148a对去卵巢小鼠骨代谢的影响目的:综合骨密度检测、Micro-CT分析、骨组织形态计量学分析、成破骨相关因子mRNA表达水平检测、血清骨转换生化指标检测评价mmu-miR-148a对小鼠骨代谢的影响。方法:将36只6周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为6组:去卵巢(Ovariectomy,OVX)+antagomiR-148a组,OVX+PBS组,OVX+阴性对照(mut-antagomir)组,假手术(SHAM)+antagomiR-148a组,SHAM+PBS组,SHAM+阴性对照(mut-antagomir)组。去卵巢小鼠模拟绝经后状态,用mmu-miR-148a的阻滞剂antagomiR-148a实现活体内骨组织mmu-miR-148a表达受抑,观察mmu-miR-148a表达受抑对去卵巢小鼠骨代谢的影响:用双能X线骨密度仪(DXA)检测股骨颈骨矿密度(bonemineraldensity,BMD);Micro-CT分析检测胫骨近端骨小梁体积比及骨小梁厚度;骨组织形态计量学分析骨形成、骨吸收参数;实时定量PCR法检测成破骨相关因子(NFATc1,TRAP及ALP)mRNA表达水平及酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测血清骨转换生化标志物(TRAP及B-ALP)。结果:(1)antagomiR-148a注射后导致小鼠体内mmu-miR-148a表达明显受抑。(2)SHAM组中,mmu-miR-148a表达受抑可导致骨密度增加,骨小梁体积比及骨小梁厚度增加,骨形成及骨吸收参数均下降,成破骨相关细胞因子mRNA表达水平及血清骨转换生化标志物均明显下降。(3)与SHAM组相比,OVX组小鼠骨密度下降,骨小梁体积比及骨小梁厚度降低,骨形成及骨吸收参数均升高,成破骨相关细胞因子mRNA表达水平及血清骨转换生化标志物均明显上升。OVX小鼠中抑制mmu-miR-148a表达可纠正上述改变。结论:mmu-miR-148a表达缺失抑制骨吸收,导致骨密度增加,骨微结构改善,阻碍骨质疏松进展。第三部分mmu-miR-148a对小鼠破骨细胞分化的功能研究目的:研究mmu-miR-148a在RAW264.7细胞及小鼠骨髓单核细胞向破骨细胞分化过程中的作用。方法:用诱导剂诱导RAW264.7及小鼠骨髓单核细胞向破骨细胞分化,qRT-PCR法检测mmu-miR-148a在此过程中的表达模式。用pSilencer4.1-CMVpuro合成mmu-miR-148a表达载体pre-miR-148a。将miRNA前体(pre-miR-148a)转染RAW264.7细胞及小鼠骨髓单核细胞,造成mmu-miR-148a过表达细胞模型,随后加入诱导剂诱导其向破骨细胞分化,行TRAP染色观察破骨细胞分化情况,实时定量PCR法检测破骨细胞分化指标TRAP/NFATclmRNA水平。将2’-O-methyl修饰的反义寡核苷酸anti-miR-148a转染RAW264.7细胞及小鼠骨髓单核细胞,构建mmu-miR-148a表达降低细胞模型,行TRAP染色观察破骨细胞分化情况,实时定量PCR法检测破骨细胞分化指标TRAP/NFATclmRNA水平。结果:(1)应用qRT-PCR检测显示,诱导RAW264.7细胞及小鼠骨髓单核细胞向破骨细胞分化过程中,随着诱导时间的延长,mmu-miR-148a表达逐渐增多。(2)用pSilencer4.1-CMVpuro成功构建]mmu-miR-148a表达载体pre-miR-148a,用pre-miR-148a转染RAW264.7及小鼠骨髓单核细胞能使细胞中mmu-miR-148a表达明显升高。(3)RAW264.7及小鼠骨髓单核细胞过表达nmu-miR-148a促进TRAP+多核巨细胞形成,破骨细胞分化指标TRAP/NFATclmRNA水平提高。(3)RAW264.7及小鼠骨髓单核细胞mmu-miR-148a表达下调则抑制TRAP+多核巨细胞形成,TRAP/NFATclmRNA水平下降。结论:mmu-miR-148a对小鼠破骨细胞分化具有正性调控作用。
【作者】陈超;
【导师】罗湘杭;
【作者基本信息】中南大学,内科学,2014,博士
【关键词】系统性红斑狼疮;hsa-miR-148a;骨密度;mmu-miR-148a;去卵巢小鼠;骨代谢;过表达;分化;

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