普罗布考预处理对高脂饮食诱导肥胖大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制

【摘要】第一部分普罗布考对高脂饮食诱导肥胖大鼠系统性炎症及脑内小胶质细胞激活的影响目的：观察普罗布考对高脂饮食诱导肥胖大鼠脂代谢、体内氧化应激、系统性炎症及脑内小胶质细胞激活的影响,探讨其对神经保护的潜在价值。方法:将40只SD大鼠随机分为两组：NG16只：给予普通饲料喂养,8周末随机抽取8只大鼠(NG8W)处死进行相关实验研究,剩余8只(NG16W)继续给予普通饲料喂养。高脂饮食组(HG)24只,高脂饲料喂养8周后随机抽取8只大鼠(HG8W)处死进行相关实验研究。第9周开始把高脂饮食组剩下的大鼠随机分为两亚组：高脂饮食组(HG16W)8只及普罗布考干预组(PB16W)8只,两组均继续给予高脂饲料喂养,PB组每天6pm给予5%普罗布考混悬液100mg/d.kg灌胃1次共8周,NG16W及HG16W组均给予不含普罗布考的0.5%羧甲基纤维素钠灌胃。各组大鼠处死前禁食12h并称重和测量体长,麻醉处死后采集血浆、肝脏、脂肪、脑等组织标本,计算大鼠Lee’s指数、体脂指数和肝指数,测定血浆TC,TG,LDL,ox-LDL,HDL,FBS,FINS,ALT,AST,hs-CRP,TNF-α,IL-1β,IL-6,SOD,MDA,T-AOC水平,计算HOMA-IR(FIRI)值,HE染色观察腹部脂肪和肝脏组织病理学变化,免疫组织化学测定脑组织中Iba-1表达情况。结果：各组大鼠体重均随着周龄增大而逐渐增加,12周后HG组体重明显高于NG组(p<0.05),在8、16周末HG组lee’s指数、肝指数、体脂指数明显高于NG组(p<0.05),普罗布考干预后,PB16W组体重增长减缓,lee’s指数、肝指数、体脂指数较HG16W组下降明显(p<0.05)。在第8、16周末NG、HG两组空腹血糖无显著性差异,而HG组Fins及FIRI明显高于NG组(p<0.05)。普罗布考干预后,PB16W组FIns及FIR/较HG16W组明显改善(p<0.05),但略高于NG16W组(p>0.05)。在16周末HG16W组大鼠肝脏ALT、AST水平明显高于NG16W组(p<0.05),出现重度肝脂肪变性,脂肪细胞直径也明显增大,存在炎性细胞浸润,普罗布考干预后,PB16W组与HG18W比较ALT、AST及肝脂肪变性程度明显下降(p<0.05),脂肪细胞直径减小,炎性细胞浸润减轻。NG16W组ALT、AST正常,无肝脂肪变性。在第8、16周末HG组TG、TC、LDL-C、Ox-LDL明显高于同期NG组(p<0.05),HDL-C水平无明显差异(p>0.05)。普罗布考干预后,PB16W组TG、TC、LDL-C、Ox-LDL较HG16W组明显下降(p<0.05),但仍明显高于NG16W组(p<0.05),HDL-C水平也明显降低(p<0.05)。在16周末HG16W组hs-CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子及脂质过氧化产物MDA水平明显高于NG16W组(p<0.05),SOD活力及T-AOC水平明显低于NG16W组(p<0.05)；普罗布考干预后,PB16W组血浆hs-CRP、TNF-α、IL-1β、IL-6较HG16W组明显降低(p<0.05),血浆MDA显著减少(p<0.05),SOD、T-AOC较HG16W组明显恢复(p<0.05),在16周末HG16W组大鼠脑内Iba-1表达(OD值)明显增加,普罗布考干预后PB16W组Iba-1表达与HG16W组比较明显减轻。结论：高脂饮食诱导肥胖大鼠模型表现出血脂异常、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝等代谢综合征表现,还存在全身抗氧化能力下降、慢性低度系统性炎症状态和脑内小胶质细胞激活。普罗布考干预可改善高脂饮食诱导肥胖大鼠全身胰岛素抵抗,抗氧化储备,减轻系统性炎症状态和脑内小胶质细胞激活。第二部分普罗布考预处理对高脂饮食诱导肥胖大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用目的：观察普罗布考对缺血再灌注损伤脑组织抗氧化能力、炎症及小胶质细胞激活的影响,探讨普罗布考预处理对高脂饮食诱导肥胖大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制。方法：将160只大鼠随机分为五组,每组32只：假手术组(Sham)、正常对照组(NG)、正常干预组(NG+PB)、高脂对照组(HG)、高脂干预组(HG＋PB)。NG+PB组：普通饲料喂养8周后,每天给予5%普罗布考(100mg/d.kg)灌胃1次共8周；Sham及NG组：给予普通饲料喂养8周后,每天给予等容积不含普罗布考的0.5%羧甲基纤维素钠(CMC)灌胃1次共8周；HG+PB组：高脂饲料喂养8周后每天加予5%普罗布考(100mg/d.kg)灌胃1次共8周；HG组：高脂饲料喂养8周后每天给等量不含普罗布考的0.5%CMC灌胃共8周。Sham组行假手术,其余四组于实验第16周末线栓法制作左侧大脑中动脉脑缺血再灌注损伤模型,缺血2小时再灌注24小时后进行神经功能缺损评分,处死动物采集脑标本,TTC染色测定脑梗死体积(11=8),干湿重法测定脑组织含水量(n=8),免疫组化法测定脑组织中IL-1β、TNF-α、Iba-1蛋白水平(n=8),缺血皮质脑组织匀浆后测定IL-1β、TNF-α、SOD、MDA、NO、NOS、iNOS含量(n=8)。结果：Sham组无神经功能缺损,HG组大鼠神经功能评分明显高于NG组(P<0.05);NG+PB组评分略低于NG组(P>0.05)；HG+PB组大鼠组评分明显低于HG组(P<0.05)。NG+PB组脑含水量稍高于Sham组(P>0.05),其余各组脑含水量明显高于Sham组(P<0.05)；NG组大鼠脑含水量明显高于NG组(P<0.05);NG+PB、HG+PB两组脑含水量明显低于对应的NG、NG组(均P<0.05)；HG+PB组脑含水量高于NG+PB组(P<0.05)。Sham组未见脑梗死灶；HG组大鼠脑梗死体积比明显高于NG组(P<0.05)；NG+PB、HG+PB两组大鼠脑梗死体积比明显低于对应的NG、NG组(均P<0.05)；HG+PB组脑梗死体积比仍高于NG+PB组(P<0.05)。免疫组织化学染色结果表明,各组缺血侧脑组织中Iba-1、IL-1β、TNF-α的.表达(OD值)均高于Sham组(均P<0.05),HG组表达均高于NG组(均P<0.05)；NG+PB、HG+PB两组表达均较对应的NG、NG组减少(均P<0.05)；但HG+PB组仍高于NG+PB组(P<0.05)。各组缺血再灌注各组脑组织SOD活力均较Sham组明显下降,而MDA含量增高(P<0.05)；HG组大鼠脑组织SOD活力较NG组下降明显,而MDA、IL-1β、TNF-α含量明显增高(P<0.05)；两干预组脑组织SOD活力均较相应对照组明显升高,而MMDA、IL-1β、TNF-α含量较相应对照组明显下降(P<0.05)。各组脑组织中NO、NOS、iNOS水平均较Sham组明显升高(P<0.05),HG组较NG组更加明显(P<0.05),两干预组脑组织NO及其合成酶NOS、iNOS活力均较相应模型组下降(P<0.05),NG+PB组和HG+PB组差异不明显(P>0.05)。结论：高脂饮食诱导肥胖大鼠缺血再灌注后脑组织氧化应激和炎症因子表达水平较普通大鼠明显升高,小胶质细胞激活及脑水肿更明显,梗死体积更大,神经功能评分更高,脑损害更严重。普罗布考预处理可显著增高高脂饮食诱导肥胖大鼠脑缺血再灌注后脑组织抗氧化能力,降低含氮自由基及炎症因子的表达,减少脑内小胶质细胞的激活。普罗布考预处理可改善高脂饮食诱导肥胖大鼠脑缺血再灌注后神经功能缺损,减轻脑水肿和脑梗死体积,保护脑缺血再灌注损伤。第三部分普罗布考预处理对高脂饮食诱导肥胖大鼠脑缺血再灌注损伤大脑皮层细胞凋亡及相关蛋白表达的影响目的：观察普罗布考预处理对高脂饮食诱导肥胖大鼠脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡和脑组织中相关凋亡因子及通路的影响,进一步探讨普罗布考对脑缺血再灌注损伤的保护机制。方法：将80只大鼠随机分为五组,每组16只：假手术组(sham)、正常对照组(NG)、正常干预组(NG+PB)、高脂对照组(HG)、高脂干预组(HG+PB)。NG+PB组：普通饲料喂养8周后,每天给予5%普罗布考(100mg/d.kg)灌胃1次共8周；sham及NG组：给予普通饲料喂养8周后,每天给予等容积不含普罗布考的0.5%羧甲基纤维素钠(CMC)灌胃1次共8周；HG+PB组：高脂饲料喂养8周后每天加予5%普罗布考(100mg/d.kg)灌胃1次共8周；HG组：高脂饲料喂养8周后每天给予给予等量不含普罗布考的0.5%CMC灌胃共8周。Sham组行假手术,其余四组于实验第16周末制作大鼠大脑中动脉脑缺血再灌注损伤模型,缺血2小时再灌注24小时后TUNEL法检测缺血大脑皮层凋亡细胞数,WesternBlot法测定Bcl-2、caspase-3、Akt、p-Akt蛋白表达水平。结果：(1)Sham组大脑皮层偶见凋亡细胞,HG组大鼠缺血大脑皮层凋亡细胞数较NG组明显增多(P<0.05),NG+PB组及HG+PB组经普罗布考预处理凋亡细胞数显著减少(均P<0.05),HG+PB组凋亡细胞数仍高于NG+PB组(P<0.05)。(2)NG组大鼠大脑皮层中Bcl-2表达水平较假手术组无明显变化(P>0.05),HG组Bcl-2表达水平较NG组升高(P<0.05)；与NG、HG组比较,普罗布考预处理能够显著上调NG+PB组及HG+PB组Bcl-2表达水平(均P<0.05)。脑缺血再灌注各组大脑皮层caspase-3蛋白表达均较假手术组增加(P<0.05),NG+PB组及HG+PB组经普罗布考预处理caspase-3表达水平显著下调(P<0.05),HG+PB组caspase-3表达仍高于NG+PB组(P<0.05)。(3)各组大脑皮质Akt总蛋白表达水平各组间无明显变化(P>0.05)。NG组Ser473p-Akt蛋白水平均较假手术组略升高(P>0.05),余各组Ser473p-Akt蛋白水平均较假手术升高(P<0.05),普罗布考预处理能够显著增加NG+PB组及HG+PB组Ser473p-Akt蛋白水平(P<0.05)。结论：高脂饮食诱导肥胖促进脑缺血再灌注后大脑皮层caspase-3蛋白表达,加重细胞凋亡,普罗布考预处理能够可使Bcl-2表达水平上调,减轻Caspase依赖细胞凋亡通路的激活,促进Akt蛋白磷酸化,减轻缺血再灌注诱导的细胞凋亡,对高脂饮食诱导肥胖大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用。
【作者】王清勇；
【导师】刘慧霞；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】普罗布考；肥胖；系统性炎症?氧化应激；胰岛素抵抗；小胶质细胞激活；脑缺血再灌注损伤；一氧化氮；炎症因子；小胶质细胞；细胞凋亡；B淋巴细胞瘤-2蛋白；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶；磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B通路；

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