ERα和ERβ在调控椎体生长板软骨细胞分化和增殖中的相互作用

【摘要】目的：初步探索ERa和ERβ基因在青春期椎体生长板软骨细胞分化和增殖中相互作用,以及Smad4基因在ERa和ERp调控软骨细胞Runx2和BMP基因表达过程中的信号传递作用。方法：应用genbank数据库检索小鼠ERα、ERβ和Smad4的cDNA序列及其转录本。设计针对ERα、ERβ和Smad4mRNA打靶的siRNA序列,构建基因沉默慢病毒载体并包装成为慢病毒颗粒。以小鼠椎体生长板软骨细胞为对象,首先分别转染ERα-shRNA-PLL3.7.ERβ-shRNA-PLL3.7、ERa-shRNA-PLL3.7+ERβ-shRNA-PLL3.7慢病毒颗粒和空白对照组研究ERa和ERβ所在软骨细胞的增殖、分化过程中的调控作用。然后采用分层设计的方法进行分组,分别转染目的基因RNAi载体,研究Smad4基因在椎板软骨细胞中介导ERa和ERβ调控Runx和BMP基因的表达的作用。分析各组细胞周期；绘制各组细胞生长曲线；检测各组细胞Runx2、BMP2表达的变化。用SPSS16.0软件分析各组差异,P<0.05为有显著性。结果：(1)经检测证明,ERα-shRNA-PLL3.7、ERβ-shRNA-PLL3.7Smad4-shRNA-PLL3.7转染细胞后相应目的基因表达明显减弱,均有显著性差异,P<0.05。(2)转染后第3、5、7、9天时,4组细胞吸光度值(A490)由高到低依次为ERβRNAi组>空白对照组>ERαRNAi组>联合沉默组,且各组间有显著性差异,P<0.05。4组细胞转染后第3天经流式细胞仪检测,结果显示处于S期和G2期细胞百分率由高到低依次为：ERβRNAi组>空白对照组>ERαRNAi组>联合沉默组,且各组间有显著性差异,P<0.05。4组细胞转染后第10天,用Realtime-PCR检测Runx2、BMP2基因表达相对于空白对照组改变的倍数由高到低依次为ERβRNAi组>空白对照组>ERαRNAi组>联合沉默组,且各组间有显著性差异,P<0.05。(3)采用分层设计进一步检测10个亚组细胞吸光度值(A490)并绘制生长曲线,结果显示,转染后第1天时,各组细胞比较均没有显著性差异,P>0.05；但是于转染后第3、5、7、9天时,10个亚组间的差异由高到低依次为ERβRNAi-ERα激动-Smad4正常组>ERβRNAi-ERα激动-Smad4RNAi组>ERβRNAi-ERα正常-Smad4正常组>ERβRNAi-ERa正常-Smad4RNAi组>ERs正常-Smad4正常组>ERs正常-Smad4RNAi组>ERαRNAi-ERβ激动-Smad4正常组>ERαRNAi-ERβ正常-Smad4正常组>ERαRNAi-ERβ激动-Smad4RNAi组>ERαRNAi-ERβ正常-Smad4RNAi组,且除ERβRNAi-ERα激动-Smad4RNAi组与ERβRNAi-ERα激动-Smad4正常组比较,以及ERβRNAi-ERα正常-Smad4RNAi组与ERβRNAi-ERα正常-Smad4正常组比较没有显著性差异,P>0.05以外,其它各组间比较均有显著性差异,P<0.05。各组间Runx2基因表达相对于空白对照组改变的倍数由高到低的顺序与细胞生长曲线基本相同。而BMP2基因表达由高到低的顺序为ERβRNAi-ERα激动-Smad4正常组>ERβRNAi-ERα激动-Smad4RNAi组>ERβRNAi-ERα正常-Smad4正常组>ERβRNAi-ERα正常-Smad4RNAi组>ERs正常-Smad4正常组>ERs正常-Smad4RNAi组>ERαRNAi-ERβ激动-Smad4正常组>ERαRNAi-ERβ激动-Smad4RNAi组>ERαRNAi-ERβ正常-Smad4正常组>ERαRNAi-ERβ正常-Smad4RNAi组,然而,无论ERαRNAi组还是ERβRNAi组中,Smad4RNAi亚组与Smad4正常亚组比较,BMP2基因表达均没有显著性差异,P>0.05。结论：ERa和ERβ均具有调控椎体生长板软骨细胞分化与增殖的作用,且ERa的调控作用大于ERβ。在ERa和ERβ均正常表达时,ERβ具有部分抑制ERa的功能；当ERa表达显著降低时,ERβ可以部分补偿ERa的功能。另外,ERp通过Smad4信号传递增强软骨细胞Runx2基因表达,但还可能存在非Smad4信号传递通路。然而,ERa和ERβ对BMP2基因表达的调控并非通过Smad4信号传递。图24篇,表格16个,参考文献104篇。
【作者】孙长英；
【导师】张宏其；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】RNA干扰；软骨细胞；青春前期；椎体；生长板；

【参考文献】
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