探究纤连蛋白和解聚素—金属蛋白酶-8在椎间盘退变中的关系
【摘要】背景：椎间盘退变是腰背痛的主要原因之一,是多因素协同共同作用的结果,椎间盘退变已成为临床上的常见问题,不仅给患者带来极大的痛苦,同时也消耗了大量医疗资源。然而椎间盘产生退变的病理机制尚不完全清楚,现阶段大部分病人通过手术治疗来缓解疼痛症状。椎间盘的退变过程不仅仅表现在形态学上的变化,更伴随着椎间盘的组织学和生化性质的系统性改变,其中椎间盘组织细胞外基质成分的丢失,导致结合水能力下降和蛋白降解这两种因素尤为重要。近年来随着实验设备的改良和实验手段的改进,对椎间盘组织的分子生物学、免疫学、病理生理学及生物力学等方面研究不断深入,这些研究将引导出治疗椎间盘退变的新理论和方法。纤连蛋白(FibronectinFN),是在细胞外基质(ECM)和血浆中发现的一种多功能糖蛋白,整个分子呈V形,它至少有20中变异体存在,这些亚单位为同一基因的表达产物,只是在转录后RNA的剪接上有所差异,因而产生不同的mRNA。纤连蛋白广泛分布于血浆、多种细胞表面及细胞外基质中。它在细胞黏附和迁移,细胞分化,细胞功能中起着重要的作用,具有多种生物活性。近年来对纤连蛋白和纤连蛋白片段在慢性疾病中的作用相关研究逐渐增多。解聚素-金属蛋白酶家族(ADisintegrinAndMetalloproteinaseFamily),为1型跨膜蛋白(含锌蛋白酶总家族),也叫去整合素-金属蛋白酶或者MDC。是锚定在细胞膜的细胞表面蛋白质家族。在调节细胞外基质的水解,细胞-细胞和细胞-基质的相互作用中至关重要。该家族涉及到膜融合(细胞粘连和细胞融合),细胞因子和生长因子的脱落,细胞迁徙的控制,以及某些进程肌肉发育,受精和细胞结局的决定。病理学中,炎症和肿瘤也受到该家族影响。纤连蛋白在关节和软骨中的作用已经被广泛研究,但其在椎间盘退变中的作用相关研究不多,认为FN以及FN-f含量的变化与椎间盘退变过程有关。相关研究表明ADAM-8在关节软骨中能够在特定位点将FN剪切为含有N-末端到VRAA位点的FN-f,从而使该FN-f含量不断积累增加,FN失去原有的生物作用和功能而加重软骨退变过程。由于软骨和椎间盘组织细胞和细胞外基质的相似性,通过对人椎间盘组织和ADAM-8转基因老鼠进行相关实验来探究ADAM-8和FN在椎间盘退变发生和发展过程中的关系。从而为治疗椎间盘退变疾病提供一些新研究方向和治疗方法。第一部分ADAM-8对于人椎间盘样品中的FN作用和影响目的：通过手术病人和器官捐赠者的椎间盘样品,进行体外实验确定在人椎间盘不同退变等级中ADAM-8基因的表达对纤连蛋白以及纤连蛋白片段的作用和影响。方法：1.人椎间盘样品的选择和收集。选取脊柱手术病人和器官捐赠者的椎间盘NP和AF组织在含有蛋白酶抑制剂的1*PBS洗涤后低温在-80℃冰箱保存。2.人椎间盘组织中定性定量蛋白质检测(WesternBlot),在不伺等级人椎间盘退变组织中检测全长FN和特定FN-f以及它们的含量变化。3.通过定性蛋白质检测和免疫组化方法来观测人椎间盘中ADAM-8的存在和分布情况。结果：1.在人椎间盘组织中,纤连蛋白N-末端抗体(MAB1936)和(VRAr71位点)能特异性识别全长FN以及含有N-末端到VRAA位点的FN-f。2.在人椎间盘组织中特定纤连蛋白片段的含量随着椎间盘退变程度增加而上升。3.通过Westernblot定性检测和免疫组化染色观测到ADAM-8存在于成年人椎间盘NP和AF组织中,并且能在特定位点剪切FN。4.在人椎间盘组织中成熟ADAM-8含量随着椎间盘退变级别增加而上升。结论：1.通过实验在人椎间盘组织中首次鉴定了含有N-末端到VRAA271位点的纤连蛋白片段。2.在人椎间盘组织中发现FN-f含量随着椎间盘退变程度增加而上升。3.们在人椎间盘中通过蛋白定性检测确定了ADAM-8的存在,并且发现其能够在特定位点将FN剪切为FN-f。4.通过研究,在人椎间盘组织中,成熟ADAM-8含量随着椎间盘退变级别增加而上升,与FN-f含量变化趋势相同。表明FN-f和ADAM-8在椎间盘退变的发生和发展过程中有重要作用。第二部分两种转基因小鼠椎间盘体内实验观测ADAM-8对纤连蛋白的作用和影响目的：通过ADAM-8转基因老鼠体内实验进一步确定,在椎间盘退变中ADAM-8基因的表达对纤连蛋白以及纤连蛋白片段的作用和影响。方法：1.在固定时间点收集敲除型(KO)和野生型(WT)两种基因型的ADAM-8转基因小鼠腰椎间盘样品,从组织学染色观测两者椎间盘退变过程。2.定性蛋白检测来研究ADAM-8和FN-fs在椎间盘退变发生和发展过程中的作用。结果：1.HE染色组织学定期观测结果显示,ADAM-8野生型(WT)型转基因小鼠椎间盘退变程度明显高于ADAM-8敲除型(KO)型转基因小鼠。2.Westernblot蛋白检测显示,ADAM-8敲除型(KO)型转基因小鼠椎间盘组织中未见VRAA抗体显色的特定FN-s,而在野生型(WT)型中可以明显被检测到。结论：通过ADAM-8两种基因型转基因小鼠体内实验,从组织形态学观察和Westernblot蛋白检测分析,结果表明／ADAM-8可以通过特定位点剪切纤连蛋白产生FN-s,从而影响到椎间盘退变过程的发生和发展。
【作者】陈丁；
【导师】王万春；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】椎间盘退变；纤连蛋白(FN)；纤连蛋白片段(FN-f)；ADAM-8；转基因小鼠；
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