γ-分泌酶抑制剂对铂耐药卵巢癌细胞化疗敏感性影响的研究

【摘要】目的：卵巢癌是一种高度恶性的妇科肿瘤，其5年生存率仅有20-30%，死亡率居妇科恶性肿瘤的首位，因其发病隐匿，又被称为“沉默杀手”。目前卵巢癌的治疗方法主要为彻底的肿瘤细胞减灭术和以铂类药物为基础的化疗，然而卵巢癌耐药问题的出现及日益加剧,直接影响卵巢癌患者的治疗效果和预后，也是卵巢癌复发、转移最常见的原因。因此，探讨卵巢癌耐药发生的相关分子机制、如何克服和逆转耐药已成为卵巢癌临床治疗的研究热点，以期提高治疗效果，改善卵巢癌患者预后。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymaltransitions，EMT）是上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。近来研究显示，EMT不仅赋予癌细胞高侵袭、转移能力，而且可赋予癌细胞干细胞样特征，促使癌细胞具有更强的生存能力及耐药性。因此，探索EMT获得过程的精确机制有助于研发靶向治疗药物，与传统化疗药物结合以提高恶性肿瘤治疗效果。Notch家族信号通路的活性在维持细胞增殖、凋亡及分化的过程中发挥着重要作用。在人类多种恶性肿瘤中（宫颈癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌等）均有notch基因的异常表达，提示notch信号通路与肿瘤的发生发展密切相关。新近研究表明，肿瘤发生发展过程中notch-1是调节EMT及癌干细胞表型获得的关键因素，而与化疗抵抗关系密切。而γ-分泌酶是激活Notch信号通路的核心环节，故抑制其在耐药肿瘤中的表达已成为逆转耐药的一种新思路。已有研究显示,γ-分泌酶抑制剂（γ-secretaseinhibitors，GSIs）能够抑制人类多种癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。但目前GSIs对耐药卵巢癌的作用及其机制知之甚少。本实验通过体外培养上皮性卵巢癌细胞株SKOV3及其耐药细胞株SKOV3/DDP，探讨铂耐药的上皮性卵巢癌细胞中是否存在Notch信号通路异常激活及EMT表型的获得，并初步研究DAPT（GSIs）能否增加卵巢癌铂耐药细胞对顺铂的敏感性及其相关分子机制，这将对改善卵巢癌患者的预后具有重要意义。方法：将SKOV3和SKOV3/DDP细胞接种于含有10%胎牛血清、青链霉素各l00U/ml的RPMI-1640培养基中，置于37℃，饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。取对数生长期细胞用于后续实验，各实验分别重复3次。1四甲基偶氮唑蓝（MTT）法取对数生长期SKOV3及SKOV3/DDP细胞，5000个/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁后,用不同浓度的DDP（0.0μg/ml、0.625μg/ml、1.25μg/ml、2.5μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml）作用于两株细胞，使每孔终体积为200μl，培养48h，计算耐药指数；用不同浓度的DAPT（25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L）作用于SKOV3/DDP细胞24、48、72h，0.35%DMSO处理的SKOV3/DDP细胞做对照，测定DAPT对SKOV3/DDP细胞的生长抑制作用；按照如下实验分组：①对照组：（0.35%DMSO）②DDP组（2.5μg/ml）③DAPT组（50μmol/L）④DDP+DAPT组（2.5μg/ml+50μmol/L），培养24h，测定两药联合作用对SKOV3/DDP细胞增殖情况的影响，并计算金正均值。2荧光显微镜下观察细胞形态用不同浓度的DAPT（25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L）作用于SKOV3/DDP细胞48h，0.35%DMSO处理的SKOV3和SKOV3/DDP细胞做对照，荧光显微镜下观察细胞形态变化。3realtime-PCR不同浓度的DAPT（25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L）作用于SKOV3/DDP细胞，0.35%DMSO处理的SKOV3和SKOV3/DDP细胞做对照，培养48h后，提取各组细胞总RNA，按照TransGen反转录试剂盒说明合成cDNA,按照CWBIOrealtime-PCR反应体系进行扩增（ABI7300系统），检测notch-1，E-cadherin及VimentinmRNA的表达水平。4流式细胞术细胞凋亡检测试剂盒按步骤AnnexinV-FITC/PI双染，检测两药联合作用对SKOV3/DDP细胞凋亡的影响。实验分组如下：①对照组：（0.35%DMSO）②DDP组（2.5μg/ml）③DAPT组（50μmol/L）④DDP+DAPT组（2.5μg/ml+50μmol/L），培养24h。5应用SPSS13.0软件进行统计学处理。以上实验均重复3次，数据以均数±标准差（x±s）表示，多组均数的比较采用单因素方差分析(one-wayANOVA)，两样本比较采用t检验。（P<0.05）认为有统计学意义。结果：1MTT结果显示，相同浓度顺铂作用48小时后，两种细胞抑制率不同，SKOV3细胞的生长抑制率较高，除0.625μg/ml组两种细胞生长抑制率无统计学意义外（P>0.05），余各浓度组两种细胞生长抑制率差异均有统计学意义（P<0.05），且随着浓度的增加，两组细胞的抑制率差异越明显；顺铂对SKOV3和SKOV3/DDP细胞48h的半数抑制浓度（IC50）分别为2.95μg/ml和14.02μg/ml，SKOV3/DDP细胞的耐药指数为4.75；不同浓度的DAPT作用SKOV3/DDP细胞24h、48h和72h后，以剂量-时间依赖的方式抑制细胞生长,同一时间不同浓度组间差异具有统计学意义（P<0.05）,不同时间相同浓度组间差异具有统计学意义（P<0.05）；DDP、DAPT组和DDP+DAPT组抑制率分别为（9.13±1.14）、（20.43±0.67）和（36.22±0.99），联合用药组抑制率均高于单一用药组，差异均有统计学意义（P<0.05），经金正均法计算，q值为1.31>1.15，表明在此浓度下，两药合用具有协同效应。2荧光显微镜下可见，对照组SKOV3细胞表现出上皮细胞样特征，细胞之间连接紧密，呈鹅卵石样排列，SKOV3/DDP细胞则表现出间质细胞样特征，细胞之间连接疏松，排列紊乱，呈长梭型；不同浓度的DAPT作用于SKOV3/DDP细胞48h后，细胞由长梭型逐渐变为短梭型，部分细胞呈卵圆形，具备上皮细胞样特征，75μmol/LDAPT处理组最为明显。3realtime-PCR检测结果显示，DAPT处理SKOV3/DDP细胞前，notch-1及VimentinmRNA表达水平显著高于SKOV3细胞，E-CadherinmRNA表达水平极低，与SKOV3细胞相比，差异有统计学意义（P<0.05）；不同浓度的DAPT作用于SKOV3/DDP细胞48h后，可使E-CadherinmRNA表达水平明显上调，VimentinmRNA表达水平明显下调，与对照组相比，差异均有统计学意义（P<0.05）；且以75μmol/LDAPT处理组最为明显。4FCM实验结果显示，Control、DDP、DAPT组和DDP+DAPT组凋亡率分别为（7.33±0.59）、（9.93±0.71）、（24.33±1.36）和（50.10±1.92），各处理组凋亡率与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05），单一用药组凋亡率均低于联合用药组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：1DAPT能够抑制SKOV3/DDP细胞的增殖，并呈剂量-时间依赖关系。2SKOV3细胞在DDP诱导耐药形成SKOV3/DDP细胞过程中发生notch-1信号通路异常激活，并获得EMT样表型，DAPT通过阻断notch-1信号通路,诱导SKOV3/DDP细胞发生间质上皮转化（Mesenchymal-epithelialtransition，MET）的形态学和分子表型改变。3DAPT能增加SKOV3/DDP细胞对顺铂的敏感性。
【作者】郭敏；
【导师】徐春琳；
【作者基本信息】河北医科大学，妇产科学，2014，硕士
【关键词】卵巢癌；化疗抵抗；上皮-间质转化；notch1；γ-分泌酶抑制剂；

【参考文献】
[1]张绍轩.低钒及非钒脱硝催化剂的研究[D].北京化工大学,化学工程与技术,2013,硕士.
[2]徐刚.合肥市部分人群艾滋病认知与行为状况干预评价[D].安徽医科大学,流行病与卫生统计学,2003,硕士.
[3]易丹.四川省氮氧化物排放现状及控制对策研究[D].西南交通大学,环境工程,2013,硕士.
[4]王文瑞,胡旭浦,潘强.宝钢炼钢和连铸管控一体化(下)[J].冶金自动化,2007,02:1-5+18.
[5]胡宇航.基于Snort的入侵防御系统的研究与实现[D].河北科技大学,计算机技术,2012,硕士.
[6]杨瑞强.无线传感器网络中虫洞攻击的研究[D].太原科技大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[7]谢博文,张国栋.全自动洗衣机控制系统设计[J].电子制作,2015,15:11.
[8]刘洪岐.基于无线传感器网络的温度场检测与评价[D].吉林大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[9]庄盛珠.引滦隧洞在线监测与安全评估系统研究[D].清华大学,水工结构工程,2003,硕士.
[10]马大为.电子交易行情预测算法研究[D].郑州大学,2004.
[11]连静.中小学教师休闲生活的研究[D].湖南科技大学,教育学,2013,硕士.
[12]谭岩.全国石油物探情报信息交流会在承德召开[J].石油地球物理勘探,1993,06:768.
[13]胡真.原油蒸馏过程的建模与优化控制[D].浙江大学,2000.
[14]王伟.面向健康智能家居的生理参数监测系统研制[D].安徽建筑大学,市政工程,2013,硕士.
[15]蔡坤.内部热耦合节能过程RBF先控策略研究[D].浙江大学,系统工程,2014,硕士.
[16]CeciliaMoiponeMokotjo（丽娅）.China’s Noninterference Policy and Its Implications: the Case of China in Sub-Saharan Africa[D].山东大学,国际关系,2013,硕士.
[17]徐泽宇.第三人侵害劳动债权研究[D].华中师范大学,法律,2014,硕士.
[18]田玫,王博.牺牲模板法制备空心结构钯纳米粒子/石墨烯复合体及其甲酸电氧化性能研究[J].无机化学学报,2014,12:2747-2752.
[19]吴雯倩.一维纳米线与填充碳纳米管复合体系结构的分子动力学研究[D].华东师范大学,2013.
[20]胡正平,宋淑芬.基于类别相关近邻子空间的最大似然稀疏表示鲁棒图像识别算法[J].自动化学报,2012,09:1420-1427.
[21]王涛.HfO_2光学薄膜激光预处理及其机理研究[D].西安工业大学,武器系统与运用工程,2014,硕士.
[22]顾德文（FefeghaInimeyaGodwin）.联合国在调解非洲领土争端中的作用[D].吉林大学,国际关系,2014,硕士.
[23]杨巍.ACS患者PCI术无复流影响因素探讨[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[24]黎灏.蒋某过失致人死亡案之分析[D].西南政法大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[25]刘海君.基于知识管理的创新服务模式[J].大学图书情报学刊,2005,04:31-33.
[26]王烁.辉山乳业公司工业旅游产品开发策略研究[D].沈阳师范大学,旅游管理,2014,硕士.
[27]刘童.随车压实度实时检测仪系统研究与算法设计[D].长安大学,交通信息工程及控制,2013,硕士.
[28]王艳霞.图像轮廓提取与三维重建关键技术研究[D].重庆大学,2010.
[29]戴智勤.安徽省麻疹流行病学特征及强化免疫效果研究[D].复旦大学,公共卫生,2012,硕士.
[30]宋月辉.EBZ160B薄煤层掘进机整机动力仿真和关键结构件有限元分析[D].河北科技大学,机械工程,2014,硕士.
[31]崔亮.石墨烯的分子级水平改性及其在药物释放领域的应用[D].青岛大学,2014.
[32]李峰.电热法制备高纯硅的基础研究[D].东北大学,化学工程,2010,硕士.
[33]高勇.CRM与个人隐私权[J].IT经理世界,2001,18:72-75.
[34]卞肖鹏.从顺应论角度看张培基的《英译中国现代散文选》[D].西安外国语大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[35]杜崩城.消炎生肌膏对湿热下注型混合痔术后症状及血清干扰素（IFN-γ）的影响[D].福建中医药大学,中医外科学（专业学位）,2013,硕士.
[36]王丹,路日亮.中国城镇化进程中的生态问题探析[J].求实,2014,05:58-62.
[37]陈璐.湖北省崇阳县滨水公园景观规划设计探讨[D].华中科技大学,艺术,2013,硕士.
[38]郝志义,刘冠军,靳淑艳.铁路电务段实施ISO9001标准的探讨[J].铁道通信信号.2003(12)
[39]张杨晓溪.“古组曲”的风格特征探析[D].西安音乐学院,钢琴演奏,2013,硕士.
[40]王高阳.先秦诸子粮食安全思想及其当代价值[D].郑州大学,国际政治,2013,硕士.
[41]刘又铭,张锦.石墨烯包覆金属纳米颗粒的合成及其在SERS中的应用[A].中国化学会.中国化学会第28届学术年会第4分会场摘要集[C].中国化学会:,2012:1.
[42]陈圆.“微时代”语境下的系列微电影的价值取向探究[D].首都师范大学,影视文学,2013,硕士.
[43]陈荣艺.电子政务中信息安全技术的应用研究[D].广东工业大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[44]王加成.粗糙集理论及其在生物发酵过程控制中的应用[D].浙江大学,2004.
[45]段华栋.一种滞环控制的LED驱动电路设计[D].广东工业大学,物理电子学,2013,硕士.
[46]朱丽静.论《洛丽塔》中戏拟手法的运用[D].河北师范大学,英语语言文学,2004,硕士.
[47]杨丽珍.SHR大鼠心血管重构中VPO1表达变化及氯沙坦的干预作用[D].中南大学,临床医学,2013,博士.
[48]王欢.我国国有企业薪酬管理的研究[D].吉林大学,行政管理,2004,硕士.
[49]孙旭辉.陕西洛川黄土/古土壤中腐殖物质的组成、结构特征及其随时间的演化[D].南京农业大学,土壤学,2012,硕士.
[50]张立涛.单环刺螠硫化物应激数字基因表达谱分析及硫双加氧酶功能研究[D].中国海洋大学,细胞生物学,2014,博士.