天然衍生脱细胞牛心包膜复合BMP-2基因转染的骨髓间充质干细胞（BMSCs）引导骨组织再生的实验研究

【摘要】引导骨组织再生(Guideboneregeneration,GBR)是近年发展起来的一项促进组织再生愈合的新理论和新技术。它指利用膜的机械屏障作用,阻止病损区周围生长较快的其它组织细胞长入病损区,消除其它组织细胞的竞争性抑制作用,选择性引导特定细胞向病损的部位附着、增生,促进病损的修复。近年,种子细胞和生物活性因子的加入,复合化和功能化的GBR膜具有更好的引导骨组织再生作用。目前以天然衍生牛心包为基础制备复合功能GBR膜的研究较少,本研究分四个部分,首先以天然牛心包为来源通过脱细胞处理和交联处理制备出符合引导骨组织再生技术要求的天然衍生GBR膜；第二部分进行骨髓间充质干细胞(BMSCs)不同方向诱导培养和BMP-2基因转染BMSCs实验研究,为下一步复合GBR膜的研究打下基础；第三部分将天然衍生脱细胞牛心包膜与BMP-2基因转染的BMSCs体外复合,检测其生物相容性和细胞增殖等情况,为下一步动物实验打下基础；第四部进行天然衍生脱细胞牛心包膜复合BMP-2基因转染的BMSCs引导骨组织再生的初步动物实验研究,探讨脱细胞牛心包膜复合BMP-2基因转染的BMSCs临床上引导骨组织再生、修复骨缺损的可行性。第一章天然衍生脱细胞牛心包膜的制备目的：筛选出一种比较理想的天然衍生牛心包脱细胞处理和交联处理方法,为制备出符合临床要求的GBR膜材料打下基础。方法：1.天然牛心包膜采用胰酶去垢剂法(Ⅰ),胰酶核酸酶法(Ⅱ),胰酶去垢剂核酸酶联合法(Ⅲ),冻融后去污剂法(IV),冻融后核酸酶法(V),冻融后去污剂核酸酶联合法(Ⅵ)进行脱细胞处理,通过光镜、扫描电镜观察,细胞毒性实验,机械性能测定,细胞趋化性实验等,筛选出最佳脱细胞处理方法。2.天然衍生脱细胞牛心包膜采用戊二醛和京尼平对其进行交联处理,通过光镜、扫描电镜观察,厚度检测,机械性能检测,交联指数测定,体外降解以及细胞毒性试验等,筛选出最理想脱细胞牛心包膜交联方法。结果：1.脱细胞结果表明：冻融去污剂核酸酶联合法处理后牛心包纤维排列致密有序,天然结构保存良好,细胞毒性低,是最理想的脱细胞方法。2.交联结果表明：京尼平交联脱细胞牛心包膜比戊二醛交联效果具有更好生物相容性,交联效果好,是最理想的交联方法。结论：冻融去污剂核酸酶联合法是制备脱细胞牛心包膜最理想的方法；京尼平交联的脱细胞牛心包膜具有更好生物相容性。第二章骨髓间充质干细胞(BMSCs)多向诱导培养及BMP-2基因转染BMSCs实验研究目的：探索兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)的分离培养方法并对BMSCs诱导,观察其多向培养潜能；进行BMP-2基因转染BMSCs实验,为GBR复合膜研究打下基础。方法：1.贴壁培养法分离培养兔BMSCs,相差显微镜观察BMSCs的生长增殖情况；取生长状态良好的第2代BMSCs,分别用成骨、成脂、成软骨诱导培养基对其进行诱导培养,然后检测BMSCs多向培养生长情况。2.传代培养良好的BMSCs,通过质粒载体,采用电穿孔法转染BMP-2基因,然后进行下列鉴定：荧光显微镜观察BMP-2转染BMSCs生长增殖情况;RT-PCR检测转染细胞的BMP-2mRNA表达;Westeblot检测BMP-2在蛋白水平的表达；ALP检测评价其成骨分化能力。结果：1.兔原代及传代BMSCs细胞生长良好；成骨诱导实验ALP染色结果阳性,茜素红染色阳性；成脂诱导实验油红O染色结果阳性；成软骨诱导实验Ⅰ型胶原和Aggrecan免疫化学染色阳性。2.BMP-2转染BMSCs的转染效率为41.2士1.1%；RT-PCR结果表明BMP-2RNA表达阳性,Westernblot结果表明转染BMSCs可有效表达转染基因；BMP-2转染的BMSCs的ALP活性明显高于空白转染组。结论：1.原代培养兔BMSCs具有多向生长能力,可成功诱导培养为脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞。2.BMP-2基因可有效成功转染BMSCs,从而为下步复合GBR膜研究打下基础。第三章脱细胞牛心包膜复合BMP-2转染的BMSCs引导骨再生的体外实验研究目的：探讨脱细胞牛心包复合BMP-2基因转染的BMSCs材料的生物相容性,细胞毒性及BMSCs在牛心包膜材料上的贴附、生长、增殖及成骨分化情况。方法：脱细胞牛心包膜体外复合BMP-2转染的BMSCs,通过扫描电镜评估细胞在脱细胞牛心包支架材料上的的贴附、生长与增殖情况,MTT检测膜材料对转染细胞的细胞毒性,ELISA检测BMP-2含量,结晶紫染色法测定BMSCs细胞粘附能力检测,ALP活性实验检测转染BMSCs成骨性能。结果：1.扫描电镜结果表明：脱细胞牛心包复合BMP-2基因转染的BMSCs后,细胞能良好的贴附并增殖。2.细胞毒性检测结果表明,各组细胞的存活率没有明显差异。3.细胞粘附能力检测结果表明：脱细胞牛心包膜增强了BMP-2转染BMSCs细胞粘附能力。4.ALP活性检测、Westernblot检测和RT-PCR检测结果表明：脱细胞牛心包膜增强了BMP-2转染BMSCs向成骨细胞转化的能力。结论：脱细胞牛心包复合BMP-2基因转染的BMSCs功能膜有良好的生物相容性和细胞相容性,可能具备更佳的引导骨再生能力。第四章脱细胞牛心包膜复合BMP-2转染的BMSCs引导骨再生的动物实验研究目的：将脱细胞牛心包复合BMP-2基因转染的BMSCs构建的功能膜植入兔下领骨骨缺损处,探讨其引导骨组织再生情况。方法：建立兔下颌骨骨缺损模型,分别植入BMP-2转染的BMSCs/脱细胞牛心包复合体(A组)、单纯脱细胞牛心包材料(B组),同时设立空白对照(C组),分别于术后第4、8、12周行大体肉眼观察,X线检测和组织形态学检测,观察其成骨情况。结果：大体肉眼观察、X线检测、组织形态学检测结果表明：术后第8周及第16周实验组A,B组骨缺损愈合情况与C组(空白对照)有显著差异,且A组优于B组(p<0.05)。结论：脱细胞牛心包复合BMP-2基因转染的BMSCs功能膜可更加有效促进兔下颌骨骨缺损修复。
【作者】白明海；
【导师】凌天牖；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】天然衍生脱细胞牛心包；间充质干细胞(BMSCs)；BMP-2；脱细胞处理；交联处理；多向生长潜能；引导骨组织再生；体外和体内实验；颌骨缺损；

【参考文献】
[1]裴建.新时期乡镇公务员伦理精神的缺失与重塑[D].沈阳师范大学,伦理学,2014,硕士.
[2]黄珍.AdaBoost算法在人脸检测中的应用研究[D].兰州理工大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[3]滕宏梅.浅析游戏精神与艺术和艺术创作的关系[D].北京服装学院,美术学,2012,硕士.
[4]闫帅.维生素D3对小鼠二甲双胍药代动力学的影响[D].兰州大学,药理学,2013,硕士.
[5]陈继红.说说本季的大衣面料[J].化学清洗.2001(12)
[6]林青山.构建知识经济时代的知识管理战略[D].福州大学,2003.
[7]王家耀.现代地图科学与地理信息工程科学技术的成就和任务[J].测绘学院学报,2004,04:235-240.
[8]刘猛,赵慧敏,全燮.基于石墨烯材料的新型荧光传感设计与应用[A].中国化学会环境化学专业委员会、中国环境科学学会环境化学分会、中国毒理学会分析毒理专业委员会.第六届全国环境化学大会暨环境科学仪器与分析仪器展览会摘要集[C].中国化学会环境化学专业委员会、中国环境科学学会环境化学分会、中国毒理学会分析毒理专业委员会:,2011:1.
[9]黄维平.黑龙江伊春小西林铅锌矿矿床成因及成矿预测[D].吉林大学,矿物学、岩石学、矿床学,2013,硕士.
[10]陈陆海.沾益烟叶主要化学成分与土壤类型、海拔、地形的相关性研究[D].湖南农业大学,作物学,2012,硕士.
[11]张纪英.动力学退耦合方法在生成簇态和自旋压缩态中的应用[D].中国科学技术大学,光学,2014,博士.
[12]李鹏珲.国内星级酒店餐饮空间策划与设计[D].湖南师范大学,设计艺术学,2013,硕士.
[13]余顺周.蒸发冷却电机垂直管内气液两相流空隙率的研究[D].中国科学院研究生院（电工研究所）,电机与电器,2003,硕士.
[14]刘迪.新世纪宁夏小说创作的本土化特征[D].宁夏大学,中国现当代文学,2014,硕士.
[15]孙胜平.中文微博客热点话题检测与跟踪技术研究[D].北京交通大学,2011.
[16]乔多.质监执法行政处罚自由裁量权控制研究[D].内蒙古大学,法律,2014,硕士.
[17]郭欣.三叶草根际氢氧化细菌的筛选及促生活性物质研究[D].西北大学,微生物学,2013,硕士.
[18]李海鹏.论我国纪检机关的监督权[D].河北师范大学,马克思主义基本原理,2012,硕士.
[19]刘璐.间歇减压蒸馏过程净化饮用水的试验研究[D].中国地质大学（北京）,环境科学与工程,2014,硕士.
[20]张娟娟.比较成人脓毒血症患者采用不同负荷剂量的亚胺培南/西司他丁的药代动力学/药效学参数差异[D].苏州大学,呼吸病学,2013,硕士.
[21]刘芳.基于灰色关联理论的我国高新技术企业人力资本投入对财务绩效（EVA）的贡献研究[D].湖南师范大学,教育经济与管理,2013,硕士.
[22]刘敬民.一类带非自治外力项的时滞反应扩散方程解的动力学行为[D].兰州大学,基础数学,2014,硕士.
[23]张洪刚.煤沥青基泡沫炭的结构控制及其复合增强[D].华东理工大学,化学工艺,2014,硕士.
[24]赵欢.Eu~(3+)掺杂二氧化钛微/纳米材料的可控合成与光谱特性研究[D].吉林大学,应用化学,2014,硕士.
[25]鲁枝鑫.2012年奥运会中国男篮与比赛队快攻战术运用效果的比较分析[D].西安体育学院,体育教育训练,2013,硕士.
[26]邱世中.基于FPGA的DES混沌加密算法实现与改进[D].广东工业大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[27]刘尚晶.新媒体视角下我国公益机制研究[D].安徽大学,传播学,2013,硕士.
[28]符艳华.论语文教师对中学生作业的优化设计[D].湖南师范大学,课程与教学论,2014,硕士.
[29]杨凯凯.乡村旅游对目的地居民社区满意度的影响研究[D].浙江大学,2008.
[30]张珂.基于CAE汽车发动机滚子摇臂体设计与成型研究[D].兰州理工大学,材料加工工程,2014,硕士.
[31]吴光旭.基于超常材料新型谐振腔的研究[D].湖南大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[32]李兆杰.高温内窥工业电视在环型加热炉中的应用[J].冶金自动化,1998,03:49-50.
[33]杨冰洁.几种紫薇属植物染色体制片技术优化及原位杂交体系的建立[D].北京林业大学,园林植物与观赏园艺,2013,硕士.
[34]杜健.JD集团物流公司业务流程重组研究[D].北京交通大学,物流工程（专业学位）,2013,硕士.
[35]宋振鑫.云纹石斑鱼早期生物学观察、苗种繁育及养殖技术研究[D].上海海洋大学,水产养殖,2013,硕士.
[36]韩月.基于稀疏性的机器学习方法研究[D].西安电子科技大学,电路与系统,2012,硕士.
[37]赵旭.拓扑绝缘体Sb_2Te_3、Bi_2Se_3薄膜电子结构及磁性的研究[D].河南师范大学,理论物理,2014,博士.
[38]周波,胡骁,周辉.挖掘机器人控制系统CAN总线接口[J].武汉科技大学学报(自然科学版),2002,03:288-292.
[39]贾骞,刘国珍.中国木材类产品的供需状况及对策[J].国际造纸.2002(06)
[40]王要敏.内燃发动机气缸体缸孔的加工及其特殊结构专能加工设备[J].组合机床与自动化加工技术.1988(05)
[41]毕澎洋.薏苡仁油和薏苡仁酯促进灵芝深层发酵的研究[D].吉林农业大学,发酵工程,2012,硕士.
[42]胡蓉.商务谈判中的恭维言语研究[D].对外经济贸易大学,外国语言学及应用语言学,2004,硕士.
[43]刘玉然,侯明亮.分数阶多目标航迹过程关联[J].控制与决策,2012,12:1854-1858.
[44]刘玲.基于混合模式的网络流量优化[D].苏州大学,计算机技术（专业学位）,2014,硕士.
[45]张强.两方程湍流模型的应用研究[D].西北工业大学,流体力学,2004,硕士.
[46]朱永王.最优消费—投资和退休选择模型研究[D].安徽工程大学,应用数学,2012,硕士.
[47]李龙男.基于生态足迹的中国省级可持续发展能力比较研究[D].吉林大学,政治经济学,2013,硕士.
[48]龚灵枝.省联社改革的模式选择分析[D].云南财经大学,金融学,2014,硕士.
[49]臧强,戴先中.非线性微分-代数系统的输出反馈镇定控制[J].自动化学报,2009,09:1244-1248.
[50]亢建忠.山西仁景医院知识型员工的工作满意度对其离职的影响研究[D].宁夏大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.