柱花草再生体系的优化及Bar基因遗传转化的初步研究

【摘要】柱花草(Stylosanthesspp.)是一种重要的豆科牧草,具有较高的蛋白含量,其在固氮、提高土壤肥力方面也功效卓越。柱花草初期生长缓慢,杂草问题一直制约着柱花草生产推广。把抗除草剂基因转入柱花草中,获得具有抗除草剂特性的品种,对于扩大柱花草的生产与利用范围有着重大意义。本项目对热研5号柱花草(Stylosanthesguianensiscv.ReyanNo.5)的再生和遗传转化体系进行了研究。对组织培养过程中各方面的条件进行改良,进而优化了柱花草的再生体系。然后对Bar基因转化的条件进行摸索,利用农杆菌介导转化的方法将抗除草剂基因Bar基因转入热研5号柱花草基因组中,并对转基因材料进行了初步的分子鉴定。结果如下：(1)热研5号柱花草愈伤组织诱导中2,4-D的适宜使用浓度范围为：0.2-1.5mg/L,6-BA的适宜使用浓度范围为：0.5-2.0mg/L。且单独使用2,4-D或6-BA均不能诱导出较好的愈伤。(2)热研5号柱花草愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA2.0mg/L+2,4-D0.5mg/L+3%蔗糖+0.75%琼脂粉,pH5.8,愈伤组织诱导率达100%；芽分化培养基为MS+6-BA2.0mg/L+3%蔗糖+0.7%琼脂粉,pH5.8,芽分化率为83.3%；生根培养基为1/2MS+0.5mg/LIAA+0.5mg/LIBA+2%蔗糖+0.8g/L活性炭+0.7%琼脂粉,pH5.8,生根率达100%。最优外植体为下胚轴上段(近子叶端)；再生苗的最佳炼苗移栽方式为：逐级开盖炼苗移栽后进行套袋保水处理,移栽成活率为96%。(3)在优化再生体系后,对柱花草Bar基因的转化条件进行摸索。研究表明：当羧苄青霉素(Car)为200mg/L时,可达到较好的抑菌效果且对愈伤组织的诱导无抑制作用；柱花草对除草剂Basta比较敏感,在愈伤组织形成初期筛选使用浓度为0.15mg/L,筛选9-10d后,筛选浓度增加到0.3mg/L;外植体材料的预培养时间确定为36h；菌株LBA4404的浸染能力强于EHA105。(4)利用上述转化体系进行转化,对目前已获得的11株抗性试管小苗进行PCR检测得出：5株抗性试管小苗基因组DNA的PCR扩增产物凝胶电泳后有目标条带出现；且荧光检测后5株抗性试管小苗均能够观察到绿色荧光,证明Bar基因和GFP基因已导入柱花草中。
【作者】钏秀娟；
【导师】罗丽娟；
【作者基本信息】海南大学，植物学，2014，硕士
【关键词】抗除草剂；热研5号柱花草；Bar基因；再生体系；转基因；

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