糖多孢红霉菌TetR家族调控基因SACE_3986的功能研究

【摘要】糖多孢红霉菌（Saccharopolysporaerythraea）是一类能产生多种复杂次级代谢产物的营土栖生活的革兰氏阳性放线菌,红霉素就是其中一类具有广谱抑菌活性的大环内酯类的次级代谢产物。自临床应用以来,红霉素类药物就是我国广泛使用的主要抗菌消炎药物之一。近些年来人们在许多其他链霉菌中发现了很多参与抗生素合成的TetR家族调控基因（SCO1712,SAV151等）,暗示着在糖多孢红霉菌TetR家族中可能存在参与调控红霉素生物合成的基因。本研究利用片段同源重组技术灭活SACE3986基因构建得到△SACE3986突变株。先PCR分别得到SACE3986基因两侧约1500bp的上下游同源臂,然后将其插入到质粒pUCTSR中硫链丝菌肽抗性基因tsr两边的相应位置,构建出质粒pUCTSR△3986；再利用片段同源重组技术用tsr基因将SACE3986基因替换构建出△SACE3986。△SACE3986与出发菌株A226在30℃条件下进行摇瓶发酵,通过对不同发酵液的枯草芽孢杆菌抑菌分析初步探讨其红霉素产量的变化,发现相比于A226,△SACE3986突变株的红霉素产量显著提高,初步的抑菌分析显示SACE3986基因可能是参与红霉素生物合成的负向调控基因。为了进一步确定SACE3986基因对红霉素生物合成的影响,对△SACE3986突变株进行了基因回复与过表达实验,将连接有SACE3986基因片段的整合质粒pIB139分别导入到△SACE3986突变株和A226中,pIB139空载体作为对照,得到回复菌株△SACE3986/pIB1393986和对照△SACE3986/pIB139以及过表达菌株A226/pIB1393986和对照A226/pIB139,HPLC检测发酵结果显示△SACE3986/pIB1393986的红霉素产量回复到A226的水平86.2%,而A226/pIB1393986的红霉素产量比A226/pIB139降低了46.7%。上述这些结果表明SACE3986是参与红霉素生物合成的负调控基因。为了研究SACE3986基因的缺失是否会影响菌株形态分化和菌体密度,对△SACE3986突变株和A226的形态分化和生物量变化进行了观察和分析。结果显示,相比A226该突变株的孢子形成无明显变化；表明SACE3986基因不参与调控孢子形成。而A226与该突变株的菌体长势基本同步,生物量变化无显著差异；表明△SACE3986突变株红霉素产量的提高并非由于自身菌体密度的改变所致。进一步在工业菌株WB中缺失SACE3986,HPLC检测结果说明在WB中缺失SACE3986红霉素产量提高37.6%-40.3%。说明在工业菌株中SACE3986同样能够调控其红霉素产量。为了探讨SACE3986基因与其上游临近基因SACE3985以及红霉素合成基因簇上eryAl和ermE以及之间的关系,从转录水平对△SACE3986突变株和A226进行了荧光定量分析；分析显示,相比A226,△SACE3986中eryAl和SACE3985基因的转录量分别提高3.7倍和5.7倍,ermE基因的转录量提高1.7倍,说明突变株中红霉素产量提高可能是由于上述三个基因的转录量增加所致。对His6-SACE3986蛋白进行了体外表达纯化来深入研究SACE3986基因调控红霉素生物合成的机制,将SACE3986蛋白分别与eryAl启动子、ermE抗性启动子和SACE3985-SACE3986进行EMSA分析,加入dI/dC为对照。EMSA结果发现SACE3986蛋白体外可以结合SACE3985-SACE3986基因间区,而不能直接与eryAI和ermE启动子结合；表明SACE3986不能直接调控eryAl与ermE,而其作用的靶基因为SACE3985,并且通过调控SACE3985基因来间接控制红霉素产量。本研究通过整合型载体将SACE3985基因引入出发菌株A226中来验证靶基因SACE3985的功能,HPLC产量分析显示靶基因过表达菌株的红霉素产量较A226提高37.8%,说明突变体中红霉素产量升高是由于SACE3985的拷贝增加所致。本课题鉴定得到负调控糖多孢红霉菌红霉素产量的TetR家族转录调控子SACE3986,在一定程度上阐明了SACE3986调控红霉素生物合成的分子机制。本课题为探索红霉素生物合成调控机制以及利用基因工程提高红霉素产量提供了理论依据和新的思路。
【作者】吴攀攀；
【导师】张部昌；吴杭；
【作者基本信息】安徽大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】链霉菌；TetR家族；SACE3986；转录调控；

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