天蓝色链霉菌代谢物组测定方法的建立和土霉素外排机制的研究

【摘要】链霉菌拥有丰富的初级代谢途径和强大的次级代谢能力,它的次级代谢产物是小分子药物的重要来源,链霉菌的次级代谢产物的生物合成受到很多复杂的调控,研究其调控的分子机制,可以为理性提高次级代谢产物的产量提供理论依据,也可为指导发现新的有价值的代谢产物。本研究论文主要包括两部分内容,一部分是建立了一种快速、准确的链霉菌胞内代谢物的分析方法：以模式菌株天蓝色链霉菌为研究对象,基于GC-MS分析平台优化了代谢组学样品制备流程中的细胞淬灭时间、菌体分离方法、代谢物提取及代谢物衍生化条件,并利用该方法对天蓝色链霉菌不同生长时期各代谢物的相对活性进行了初步分析。采用“低温淬灭(-40℃,4min)-快速过滤分离-反复冻融(45s/3min)-衍生化(40℃,90min)”的流程能够鉴定出中心代谢途径(糖酵解、戊糖磷酸途径和TCA循环)、氨基酸代谢途径、脂肪酸代谢途径、核酸代谢途径及部分次级代谢途径中的103种主要代谢物。利用该流程测定发现天蓝色链霉菌细胞生长周期中存在显著的代谢时序差异,并且发现氨基酸与脂肪酸代谢在衔接初级代谢与次级代谢生物合成中具有重要作用。本研究建立的测定方法能够有效地用于天蓝色链霉胞内代谢分析,该方法将有助于深入刻画链霉菌细胞代谢过程,为菌株代谢工程改造增加次级代谢产物产量提供理性指导。第二部分工作是土霉素合成调控蛋白OtrR及其与土霉素相互作用关系的研究。很多微生物能够产生具有抗生素活性的分子,使之在与外界其他微生物共存时具有竞争优势,但是这些抗生素小分子积累至一定浓度时往往对自身也产生毒害作用,因此要利用外排系统将合成的这些次级代谢产物运出体外。其中比较有代表性的是TetR-tetA外排系统,TetR调控蛋白通过N端DNA结合结构域直接结合靶DNA,抑制外排基因tetA的转录,当自身产生的抗生素类小分子达到一定浓度时,可以与TetR蛋白C端配体的结合结构域结合,导致蛋白构象发生改变,使其从靶DNA上解离下来,从而能够解除对靶基因外排泵基因的转录抑制,使抗生素小分子泵出体外,这样的系统我们称之为“TetR调控蛋白-抗性基因”系统。本工作的研究对象是龟裂链霉菌的土霉素合成基因簇中的调控基因OtrR与外排泵基因otrB。这两个基因反向转录,与产金霉素的金色链霉菌的CtcS-ctcR和大肠杆菌的TetR-tetA排布相同。途径特异性调控蛋白与外排泵基因在基因组上毗邻,而且反向转录,我们推测其外排泵基因可能也受其调控蛋白的直接抑制。OtrR是MarR家族的蛋白,通常以二聚体形式存在直接与DNA结合,很多MarR蛋白是抑制蛋白,小分子通过有活性的半胱氨酸残基可与MarR结合将蛋白从DNA上解离下来。首先我们对OtrR进行了异源表达和纯化,得到了纯度较高的带有His标签的重组蛋白,然后通过体外EMSA实验证实OtrR不仅与自身启动子PotrR-otrB结合,也能与金色链霉菌抗性调节蛋白CtcR启动子PctcR-ctcS结合。因此,我们推测PotrR-otrB和PctcR-ctcS中可能存在相对保守的结合序列。通过序列同源性比对得到PotrR-otrB和PctcR-ctcS共同存在的14bp的发夹结构,初步推测P14bp可能是OtrR结合的靶序列。体外EMSA实验与SPR实验均证明这段序列可与OtrR结合,且SPR实验得到OtrR与结合的靶序列的亲和力为0.14nM。SPR实验结果亦表明OtrR能够与自身产生的抗生素土霉素素结合。我们通过实验证明,除土霉素外,四环素类抗生素,四环素,强力霉素,金霉素都能解除OtrR对自身的抑制。这也印证了我们之前的猜想,OtrR-otrB行使着“TetR-tetA调控蛋白-抗性基因”的功能。
【作者】李宜鸿；
【导师】张部昌；
【作者基本信息】安徽大学，微生物，2014，硕士
【关键词】链霉菌；代谢物组；土霉素；次级代谢调控；

【参考文献】
[1]王倩.发光混凝土的制备及性能研究[D].沈阳建筑大学,材料物理与化学,2013,硕士.
[2]高晋.聚酰亚胺纤维的制备及结构与性能[D].东华大学,材料学,2004,硕士.
[3]张睿.客户导向下的电信运营企业产品创新研究[D].东北财经大学,2005.
[4]翁青芳.当前高中文理生学习立体几何差异的比较研究[D].杭州师范大学,数学教育（专业学位）,2011,硕士.
[5]刘飞飞.社会体育人才需求与民办高校社会体育专业人才培养[D].湖南师范大学,民族传统体育学,2013,硕士.
[6]李骏,张振华,王成志,邓小清,范志强.石墨烯纳米带卷曲效应对其电子特性的影响[J].物理学报,2013,05:300-307.
[7]谢冰洁.竹材特性在家居产品中的应用与创新[D].浙江理工大学,艺术设计（专业学位）,2014,硕士.
[8]张旭,沈沉,梅生伟,陈颖.基于自激法的小干扰稳定特征值的分布式算法[J].电力系统自动化,2007,13:12-16.
[9]刘摇瑞,赛景波.铁路GSM-R干扰模型及快速干扰识别与判定方法[J].铁道标准设计,2014,02:101-105.
[10]李海龙.居住环境景观设计中的吉祥寓意研究[D].苏州大学,设计艺术学,2013,硕士.
[11]雷瑞德.山航不正常航班恢复策略评估体系研究[D].山东大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[12]王慧.1956-2011年环渤海地区气候的变化特征及其与ENSO的相关性分析[D].西北师范大学,自然地理学,2013,硕士.
[13]温宏宇.公交车专用道违规车辆识别系统研究[D].大连海事大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[14]马荆亮,王殿龙,陈飞,方明学.石墨烯/硫酸铅复合材料的制备及其在铅酸电池中的电化学性能(英文)[J].无机化学学报,2013,09:1935-1941.
[15]朱延鑫.两自由度碰撞振动系统的光滑及非光滑动力学研究[D].西南交通大学,一般力学与力学基础,2014,硕士.
[16]朱敏宁.反射式轴向偏振针形场的特性研究[D].上海大学,光学,2014,硕士.
[17]董世宇.徽州古村落物质空间研究[D].湖南大学,建筑学,2012,硕士.
[18]高延.远端保护装置的心肌保护作用及其机制的研究[D].第四军医大学,内科学,2004,硕士.
[19]王洪森.基于竞争型ISPO双胞支持向量回归短期负荷预测[D].广东工业大学,电气工程（专业学位）,2014,硕士.
[20]舒文琼,覃庆玲,管黛,项方伟.移动博客专题报道(二)移动博客宜走融合之道[J].通信世界.2008(07)
[21]尹晓峰,刘春煌.行车安全监测数据关联规则的研究[J].铁路计算机应用,2004,01:5-7.
[22]张斯絮.当代中国三大音乐舞蹈史诗的音乐比较研究[D].中央音乐学院,中国近现代音乐史,2012,硕士.
[23]朱耀.沁尿系统肿瘤个体化临床预测模型的建立、验证和优化的研究[D].复旦大学,肿瘤学,2013,博士.
[24]徐立苗玥邢俊风.解析CT图像中边缘病变的二维肺野分割[J].电子技术与软件工程,2014,05:107.
[25]余滔.数控实训室客服支援系统的开发与实现[D].南昌大学,计算机应用,2012,硕士.
[26]刘东霞.具有感染和易感年龄结构的媒介传染病模型分析[D].信阳师范学院,应用数学,2014,硕士.
[27]郭滏林.氧化应激状态下CDK1对caspase-2及高尔基体形态的影响[D].中南大学,临床医学,2014,博士.
[28]付莉.无线移动IC卡公用电话系统技术规范(三)[J].电信网技术.2000(03)
[29]韩彦芳.广巴高速公路某路段暴雨水毁机理及稳定性研究[D].西南交通大学,地质工程,2013,硕士.
[30]王龙.甘肃省能源消费二氧化碳排放分析及减排对策研究[D].兰州理工大学,环境工程,2013,硕士.
[31]王俊海.大跨度连续刚构桥悬浇施工支撑系统力学特性研究[D].长安大学,建筑与土木工程（专业学位）,2014,硕士.
[32]丁珏华.我国中小企业赴美上市问题及对策研究[D].苏州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[33]方晓玲.形式三角矩阵环及其上的一些摸[D].安徽大学,基础数学,2014,硕士.
[34]李纯菊.动态脑电图机系统设计及高频振荡信号提取算法研究[D].广东工业大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[35]江闪闪.网络社区的知识组织体系研究[D].郑州大学,情报学,2013,硕士.
[36]蔡吉燕.贵阳市郊布依语使用现状及其语言变异[D].贵州民族大学,中国少数民族语言文学,2012,硕士.
[37]梁芮.基于D-S证据理论的认知无线电协作频谱感知算法研究[D].西南交通大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[38]刘静.声音商标法律问题研究[D].海南大学,民商法学,2014,硕士.
[39]江南.网格,在身边延伸[J].中国计算机用户,2004,39:62-63.
[40]解翔,曹阳,袁越,郭思琪.基于阶梯峰谷电价的微网柴油机组节能减排效益分析[J].电力系统自动化,2014,08:1-6.
[41]吴潇.秦皇岛经济技术开发区服务型政府建设研究[D].燕山大学,公共管理,2013,硕士.
[42]欧阳君杰.Fe_2O_3、ZnO纳米晶的表/界面结构控制及其相关性质的研究[D].厦门大学,物理化学,2014,硕士.
[43]江伟涛.近代江南的城镇化水平研究[D].复旦大学,历史地理学,2013,博士.
[44]亓希龙.校园巡逻机器人定位与避障技术研究[D].山东大学,控制科学与工程,2013,硕士.
[45]王莹.纳米材料的制备及其在蛋白激酶活性检测中的应用[D].南昌大学,2014.
[46]张仁柱.基于FPGA的红外图像增强处理的研究[D].燕山大学,电路与系统,2014,硕士.
[47]李俊华.数控磁悬浮球系统的研究与实现[D].南京航空航天大学,机械设计与理论,2004,硕士.
[48]詹争艳.梅兰芳演艺生活的记录与见证[D].厦门大学,戏剧戏曲学,2014,硕士.
[49]代霞.光催化选择性氧化芳香醇到芳香醛还原硝基苯到苯胺耦合体系的研究[D].淮北师范大学,应用化学,2014,硕士.
[50]蔡春雨.各向异性抛物量子点中量子比特的性质[D].内蒙古民族大学,2013.