产1，3-丙二醇基因工程菌的构建

【摘要】1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,在聚酯合成领域有很好的应用前景,其生物生产方法已经引起了广泛的重视。在主要的1,3-PD生产菌之一——克雷伯肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)中,甘油通过两个酶转化成1,3-PD,分别是甘油脱水酶(GDHt)和1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)。本实验克隆了K.pneumoniae中编码1,3-丙二醇氧化还原酶的基因dhaT,在大肠杆菌中进行了表达研究。采用胞内表达方式,1,3-丙二醇氧化还原酶以很好的可溶性蛋白存在,酶活达到96.8U/ml。经亲和层析纯化后,研究了重组1,3-丙二醇氧化还原酶的pH稳定性及温度稳定性,重组酶的最适pH为9.5,最适温度为30℃。克隆了K.pneumoniae中编码甘油脱水酶的dhaB基因,构建了三种不同的表达质粒,在大肠杆菌中进行了表达研究。SDS-PAGE和酶活分析结果表明,直接表达整个阅读框架时,只有α亚基得到表达；串连表达时,在基因之间引入人为设计的RBS序列,能够有效的表达甘油脱水酶的三个亚基；融合表达则是去掉了dhaB1及dhaB2的终止密码,在两两亚基之间各引入了10个简单氨基酸残基。串连表达方式的酶活最高,经进分离纯化后酶活达90U/mg。克隆了甘油脱水酶再激活因子的基因(gdrAB)并在大肠杆菌中实现了表达,作为甘油脱水酶的分子伴侣,再激活因子能够有效的激活失活的甘油脱水酶,使得甘油脱水酶在催化甘油转化为3-羟基丙醛时的活力大大提高。利用含有不相容质粒的重组大肠杆菌系统,双质粒共同表达1,3-丙二醇代谢途径中的关键酶基因dhaB和dhaT,以及甘油脱水酶再激活因子基因gdrAB,在有选择压力存在的条件下,重组菌可以保持较好的质粒稳定性,同时可以有效的表达目的蛋白。另外尝试了使用1,3-丙二醇氧化还原酶的同功酶——醇氧化还原酶编码基因yqhD替代dhaT,构建的两株重组菌的1,3-丙二醇产量分别达到8.6g/l和13.2g/l。为了提高K.pneumoniae的生产强度及效率,本实验构建了表达质粒pKP-28a-dhaBY,并在K.pneumoniae体内进行表达,利用重组菌生产1,3-丙二醇,无论在厌氧还是微氧条件下,重组菌1,3-丙二醇代谢途径关键酶的酶活显著提高。对构建的重组克雷伯肺炎杆菌进行了微氧发酵,转化率比厌氧时稍微降低,但1,3-丙二醇浓度和生产强度有所提高。在微氧条件下以葡萄糖为辅助碳源进行发酵,初始添加8g/l葡萄糖可以将生产强度提高30%以上；以甘油：葡萄糖=8：1的比例补料可以将甘油转化率提高16%；发酵初始和补料均添加葡萄糖时,重组菌的1,3-丙二醇浓度、甘油转化率和生产强度比野生克雷伯菌依次提高了19.2%、8.3%和19.2%。采用重组克雷伯肺炎杆菌结合微氧和加糖的补料批式发酵,1,3-丙二醇浓度(69.5g/l)、甘油转化率(0.65mol/mol)和生产强度(2.32g/lh)比最初的野生型厌氧发酵的1,3-丙二醇浓度(55.6g/l)、甘油转化率(0.54mol/mol)和生产强度(1.25glh)依次提高了25%、20.4%和85.6%,而且发酵过程中乳酸含量极低。为了提高重组K.pneumoniae的产物耐受力从而提高产量,本研究使用紫外线一氯化锂复合诱变联合菌种驯化的方法,对构建的重组Kpneumoniae进行了诱变与筛选工作,获得了可耐受较高1,3-丙二醇浓度的优良突变菌株M-5。与诱变驯化前相比,1,3-丙二醇产量提高了24%,乙酸产量也有相应的提高,而乙醇产量有所降低。与最初的野生克雷伯肺炎杆菌厌氧发酵相比,1,3-丙二醇产量提高了56.1%,生产强度提高了131.5%。经过30L发酵罐放大,产量基本维持在87g/l。通过同源重组的手段敲除了Kpneumoniae的乙醛脱氢酶基因。摇瓶筛选得到了三株突变菌株,将乙醇产量最低的6号突变株应用于发酵中,发酵进行到12h～16h,菌体停止生长,代谢也基本停止,不再产生1,3-丙二醇,和亲株同期相比,生物量少了3个OD,乙醇浓度减少了37%,乙酸浓度比亲株同期增大了一倍,菌体生长受到明显影响。通过驯化提高菌体对乙酸的耐受力有望改变这种不利状况。
【作者】王凤寰；
【导师】谭天伟；
【作者基本信息】北京化工大学，生物化工，2007，博士
【关键词】1,3-丙二醇；克雷伯肺炎杆菌(K.pneumoniae)；1,3-丙二醇氧化还原酶；甘油脱水酶；再激活因子；重组菌；驯化；发酵；

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