布氏锥虫elF4E蛋白的表达纯化与晶体生长

【摘要】论文由布氏锥虫eIF4E蛋白和斑马鱼MO25蛋白初步晶体学研究两部分组成。布氏锥虫属动基体目、锥虫科中的锥虫属,是致病的鞭毛原虫寄生,可引发严重的传染病。在人类中主要为昏睡病,南美锥虫病和利什曼病,流行于非洲,通过采采蝇传播。对人类和其他动物健康造成极大的干扰。目前,对这些寄生虫有效的疫苗的开发仍是一个难以实现的目标,而临床治疗手段仅限于化疗。常规药物的成本,毒性和抗药性问题导致迫切需要确定和开发新的治疗方向,而此关键是确立新的先导结构和新的药物靶标。真核细胞翻译起始因子4E(eukaryotictranslationinitiationfactor4E,eIF4E)最初发现时为分子量为25KD的多肽。主要分布在细胞胞质内,细胞核内分布少量,与mRNA的5’端帽子结构特异性结合,在帽子依赖性翻译和mRNA输出发挥重要的调控作用。它多以游离或形成复合物存在,它能被其他蛋白所调节,如与支架蛋白eIF4G结合作为eIF4F复合物的一部分介导发挥其功能以及能够结合eIF4E蛋白远端背侧表面到帽子结合位点,并能调节帽子结合活性4EBPs(eIF4Ebindingproteins)蛋白。这两种蛋白质可增加eIF4E蛋白与5’cap结合的亲和力。在布氏锥虫中,真核生物翻译起始因子eIF4E(TbeIF4E)分为四个亚型(TbeIF4E1–4),同时它们在生物体内,行使不同功能。目前布氏锥虫的eIF4E蛋白结合相关蛋白和调控翻译过程的途径仍然不清晰。因此我们构建了布氏锥虫eIF4E1(1-233aa)-C-His-pET22b,eIF4E2(1-25laa)-C-His-pET22b,eIF4E3(1-442aa)-C-His-pET28a,eIF4E4(1-427aa)-C-His-pET22b重组表达质粒。通过表达检测只获得eIF4E1的可溶性蛋白。再经过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化和Superdex200凝胶过滤层析后,SDS-PAGE检测后收集纯度较高较均一的蛋白坐滴气象扩散法进行晶体生长。M025是一种保守的支架蛋白,它与假激酶STRAD共同激活肿瘤抑制基因LKB1从而发挥调控功能。M025同样也能促进STE20家族激酶MST3,MST4,STK25,SPAK以及OSR1的活性。因此,我们纯化并结晶了斑马鱼的M025(DrM025)蛋白,然后采用X射线衍射,获得晶体衍射分辨率达到2.9A。此结构属于空间群为P3221,晶胞参数为α=b=156.665A,c=221.251A.此外,通过分子置换的方法对斑马鱼M025的结构进一步确认。斑马鱼M025由七个重复的螺旋组成,通过结构对比表明斑马鱼与人的M025整体结构非常相似。我们的工作为M025的进一步的功能和进化研究提供了一个结构基础。
【作者】张珍珍；
【导师】张敏；
【作者基本信息】安徽大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】布氏锥虫eIF4E；重组表达纯化；晶体生长；斑马鱼MO25；晶体结构；

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