丝裂霉素联合尼美舒利对膀胱癌EJ细胞的影响及机制研究

【摘要】膀胱癌是最常见的泌尿系肿瘤,单纯手术切除后复发率较高,肿瘤复发的预防是目前研究重点,联合应用不同作用机制的药物取得了较好的效果,目前国内外针对尼美舒利联合丝裂霉素作用于膀胱癌的研究较少。目的：研究环氧化酶-2(Cox-2)选择性抑制剂尼美舒利(NIM)与丝裂霉素(MMC)联合应用对体外培养人膀胱癌细胞株EJ细胞增殖,凋亡及细胞周期的影响,研究凋亡相关基因Bax和Bcl-2两种蛋白在EJ细胞上的表达情况。方法：1细胞选用人膀胱癌EJ细胞,作用培养时间分别为24h、48h、72h。2实验分组：采用随对照原则分对照组和实验组,对照组即不做处理的细胞培养液作阴性对照,实验组按实验药物不同分3组：MMC组：浓度为2mg/L；NIM组：浓度300umol/L;联合组：MMC(2mg/L)+NM(300umo]/L)。3对照组和实验组培养24h,48h,72h,MTT检测细胞增殖抑制情况。4对照组和实验组培养24h、48h、72h,通过流式细胞仪(FCM)用AnnexinV-EGFP检测细胞凋亡,用PI染色检测细胞周期。5对照组和实验组培养48h,用S-P免疫组织化学染色法观察人膀胱癌细胞株中Bax和Bcl-2蛋白的表达情况。6实验数据采用SPSS11.5统计软件处理。计量数据以均数±标准差(x±s)表示,采用方差分析进行统计,P<0.05有统计学意义。结果：1.MTT法测定处理后EJ细胞增殖抑制情况在药物作用24h,48h,72h后,不同培养时间的平均细胞数减少,实验组即MMC组、NIM组、联合组与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。在相同的作用因素下,作用72h后分别与24h、48h比较,差异有统计学意义(P<0.05)。在相同作用时间内,联合组与两个单药组之间比较,有统计学意义(P<0.05)说明药物处理对细胞能产生一定的抑制效应,并且随时间延长,实验组活细胞的数量减少,以处理72h后联合组的活细胞数量减少最明显。2.流式细胞仪检测EJ细胞的结果：2.1EJ细胞凋亡率：在作用24h,48h,72h后,在相同作用时间内,实验组仅MMC组、联合组与对照组之间的细胞凋亡率差异有统计学意义(P<0.05),NIM组与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。在相同处理因素作用下,随时间延长,MMC组和联合组凋亡细胞百分率均有所增加,但这两个组之间差异无统计学意义(P>0.05),NIM组凋亡细胞百分率随时间延长无明显变化(P>0.05)。2.2EJ细胞死亡率：在作用24h,48h,72h后,在相同作用时间内,实验组与对照组之间的细胞死亡率差异有统计学意义(P<0.05),在相同处理因素作用下,随时间延长,实验组各组间死亡细胞百分率均有所增加,以处理72h后联合组细胞死亡数量最多,有统计学意义(P<0.05)。3.流式细胞仪检测EJ细胞的细胞周期分布：在作用24h,48h,72h后,在相同作用时间内,实验组仅NIM组、联合组与对照组之间的G1期的细胞所占百分比差异有统计学意义(P<0.05),MMC组与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。在相同处理因素作用下,随时间逐渐延长,NIM组和联合组将细胞阻断于Gl期的细胞百分比均有所增加,但这两个组之间差异无统计学意义(P>0.05),说明NIM可影响细胞周期并阻断膀胱癌EJ细胞于G1期。4.免疫组化法观察处理48h后细胞中Bax和Bcl-2蛋白的表达情况：免疫组化结果显示,MMC组、NIM组、联合组中Bax蛋白的表达有所增加,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；联合组与MMC组,NIM组比较也有统计学意义(P<0.05)。两个单药组Bax蛋白表达率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。MMC组、NIM组、联合组中Bcl-2蛋白的表达均降低,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。联合组与MMC组,NIM组比较也有统计学意义。两个单药组Bcl-2蛋白表达率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。联合组Bcl-2蛋白的表达呈阴性。结论：丝裂霉素联合尼美舒利对于抑制体外培养的膀胱癌EJ细胞增殖有协同作用；Cox-2抑制剂尼美舒利可增强EJ细胞对丝裂霉素的敏感性,其机制可能与尼美舒利将细胞周期阻滞于G1期有关；丝裂霉素联合尼美舒利作用于膀胱癌EJ细胞,可诱导其凋亡,其机制可能是与上调Bax、下调Bcl-2蛋白表达有关。
【作者】李富博；
【导师】李青山；
【作者基本信息】承德医学院，肿瘤学，2011，硕士
【关键词】Cox-2抑制剂；丝裂霉素；尼美舒利；膀胱癌；EJ细胞系；细胞周期；Bcl-2/BaX；

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