Taq DNA聚合酶的结构修饰与表征

【摘要】本论文根据TaqDNA聚合酶的结构与功能信息以及前人对该酶的研究,对TaqDNA聚合酶基因进行了结构修饰,并对修饰后的聚合酶活性进行了表征,旨在提高酶对抑制剂的耐受程度,使其既可以应用于普通PCR体系和实时荧光PCR体系中,也可以应用于全血和土壤提取物直接扩增的体系。第一章,概述了PaqDNA聚合酶的发现、性质、结构及其在PCR技术中的应用。TaqDNA聚合酶应用广泛,但在临床应用中仍有诸多不足之处。通过对TaqDNA聚合酶进行结构改造或化学修饰,可以降低或消除酶的5’-3’核酸外切酶活性,提高酶的耐热性、续进性、忠实性、特异性、对抑制剂的耐受程度以及使酶具有热启动活性等。第二章,我们利用基因工程技术对TaqDNA聚合酶进行改造。首先,通过定点突变对酶的3个氨基酸位点进行突变,即E626K、I707L和E708Q。其中E626K和1707L这两个位点的突变可以提高酶的最适反应温度,减少非特异性产物的扩增。E708Q的突变可以显著提高酶对多种PCR抑制剂的耐受能力。其次,通过缺失突变去除了酶N端的278个氨基酸,以消除酶的5’-3’核酸外切酶活性。在基因突变改造后,我们还对改造后的酶进行柠康酸酐修饰,以使其具有热启动的效果,从而减少PCR扩增中引物二聚体及非特异性产物的扩增。第三章,对改造后的酶—KT-C3DNA聚合酶的性质进行表征。首先,考察该酶的热稳定性和最适反应温度。结果显示KT-C3DNA聚合酶具有较高的热稳定性,在95℃加热4h后还能进行正常的PCR扩增,它的最适延伸温度比普通TaqDNA聚合酶提高约4℃,较高的延伸温度可以有效减少引物二聚体及非特异性产物的扩增。其次,考察KT-C3DNA聚合酶在实时PCR体系中的应用性能,并与商品TaqDNA聚合酶及具有热启动活性的Taq-HS(Takara)作对比。发现该酶具有与商品酶相当的扩增效果和灵敏度。第三,考察KT-C3DNA聚合酶对乙醇、SDS、NaCl的耐受程度,及在全血和土壤提取物中的扩增性能,发现该酶可以耐受10%的乙醇、0.048%的SDS、100mM的NaCl。可以在35%及以上的全血中进行很好的扩增,而且在含有5%的全血中还能达到1×101copies/μL的扩增灵敏度,柠康酸酐修饰后的KT-C3DNA聚合酶还能耐受10μL/反应的土壤提取物,并且在含有4μL/反应的土壤提取物中还能达到1×100copies/μL的扩增灵敏度。说明KT-C3DNA聚合酶对抑制剂的耐受程度远远高于一般的商品酶。一定程度上降低了PCR反应对模板的要求,扩大了PCR技术的应用范围。对促进DNA聚合酶的发展和PCR技术在分子诊断技术上的应用都具有重要意义。
【作者】郭佳；
【导师】李庆阁；
【作者基本信息】厦门大学，细胞生物学，2014，硕士
【关键词】TaqDNA聚合酶；KT-C3DNA聚合酶；PCR抑制剂；

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