磷脂酶D通过Wnt信号通路促进人结肠癌细胞增殖和侵袭

【摘要】结肠癌是消化道中最常见的恶性肿瘤之一,发病率在恶性肿瘤中位居第四,严重威胁人类的健康。近年来结肠癌的发病率仍呈不断上升趋势。磷脂酶D(PhospholipaseD,PLD)是维持机体正常功能的重要酶类,在哺乳动物体内存在两种亚型：PLD1和PLD2。多种癌症中均伴有PLD的异常表达和活化现象,虽然大量文献报道PLD涉及参多种类型肿瘤的进程,但是,对PLD的调控和作用机制我们仍所知甚少。Wnt/β-catenin信号通路的异常活化以及靶基因的过度活化与多种癌症相关。最新研究揭示PLD作为P-catenin/T-cellfactor(TCF)的转录靶标,并通过PLD强化细胞的增殖和转移。然而,对Wnt信号通路参与PLD的作用机制的报道还比较少。本课题将以这一方向展开研究,继续深入探讨PLD与Wnt信号通路之间的关系。我们以体外培养的人结肠癌细胞系KM12C、KM12SM,PLD稳定转染细胞株和裸鼠荷结肠癌模型为研究对象,对PLD的生物学功能以及调节机制进行了较为深入的探讨,尤其是探讨PLD与Wnt信号通路在诱导细胞增殖和侵袭中的作用机制。我们首先采用MTT法分别测定两种细胞系经PLD质粒转染24h后的细胞增殖存活率。结果表明,PLD对KM12C和KM12SM细胞具有明显的存活促进作用。为了探讨PLD是否具有诱导人结肠癌细胞迁移的能力,我们首先采用细胞划痕实验,观察到PLD可以有效诱导KM12C和KM12SM细胞发生迁移。同时,我们还用westernblot检测了PLD对β-catenin蛋白在细胞核和细胞浆内的表达变化的影响。结果发现在PLD过表达的KM12C和KM12SM细胞中β-catenin蛋白在细胞核内的表达水平均明显提高,细胞质中的β-catenin蛋白表达水平降低。进而我们观察经不同浓度PLD质粒转染的KM12C细胞中Wnt下游基因c-Myc和cyclinD1的细胞全蛋白表达水平。结果显示,c-Myc和cyclinD1的蛋白表达量随着PLD的表达增多而升高,而β-catenin蛋白表达的变化不明显。接着,我们构建了高表达PLD的人结肠癌细胞KM12SM稳定转染细胞株,为了进一步的探究PLD在结肠癌细胞中的作用机制,我们分别采用了MTT、RealtimePCR、荧光素酶报告基因和transwell细胞侵袭的实验方法检测了PLD稳定转染细胞株的生物学功能和Wnt信号通路活性的变化情况。MTT的结果显示稳转株细胞增殖率较对照组细胞显著提高；RealtimePCR和荧光素酶报告基因实验的结果显示,稳转细胞株中Wnt/β-catenin的转录活性显著提高,靶基因c-Myc、cyclinD1的mRNA表达水平也明显上升；transwell细胞侵袭实验和westernblot的结果显示,稳转细胞株中MMP2和MMP9的全蛋白表达水平以及细胞迁移、侵袭能力均显著提高。最后,建立裸鼠移植瘤模型,证实高表达PLD可以在裸鼠体内促进人结肠癌KM12SM细胞的增殖生长,并同步观察到肿瘤组织中P-catenin蛋白在细胞核内的表达显著提高,Wnt信号通路下游基因c-Myc、cyclinD1和细胞增殖标志蛋白PCNA、Ki67的表达水平均明显增强。综上所述,本论文的研究结果证实了PLD具有促进人结肠癌细胞的存活增殖及细胞迁移、侵袭的能力,并且显示PLD通过提高Wnt信号通路的活性促进人结肠癌细胞增殖和转移,促进β-catenin蛋白入核进而转录活化Wnt信号通路靶基因的表达可能是其调节结肠癌细胞增殖和转移的分子机制之一。通过这些研究,较为详细地阐明了PLD在体内外对人结肠癌细胞存活增殖的促进作用与机制,为以PLD为靶点的肠癌药物开发奠定理论基础。
【作者】高雅；
【导师】胡天惠；
【作者基本信息】厦门大学，生理学，2014，硕士
【关键词】结肠癌；PLD；Wnt信号通路；

【参考文献】
[1]索妍.外国劳动移民对俄罗斯经济发展的影响分析[D].哈尔滨工业大学,国际贸易学,2013,硕士.
[2]刘惠杰.论信用资产在外商直接投资中对无形资产价值的效用分析[D].天津财经学院,国际贸易学,2004,硕士.
[3]王美玲.西安凯瑞科技有限公司市场营销策略研究[D].西北大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[4]黄春花.我国期货市场交易品种问题研究[D].西南财经大学,金融学,2004,硕士.
[5]郭小强,魏宝泽,杨秋霞,赵清林,王宝诚,孙孝峰.六开关光伏并网逆变器共模漏电流抑制方法[J].电力系统自动化,2014,14:101-105.
[6]赵怀霞,杨雷,罗树琼,管学茂.烧成温度对污水处理用陶粒的性能影响[J].硅酸盐通报,2015,02:571-574+580.
[7]陆承炳.煤炭企业内部控制体系构建研究[D].吉林大学,会计,2013,硕士.
[8]渠慎建.渔业用无线转接器的设计与实现[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2012,硕士.
[9]阮晓勇.证券信息披露法律制度研究[D].苏州大学,法律,2003,硕士.
[10]周效东,汤书昆.构建面向CRM的商业银行客户经理制[J].科技管理研究,2003,02:68-71+86.
[11]曹国栋.可编程序控制器在设计中的选型与应用[J].冶金自动化,1991,06:51-53.
[12]王霁雯.高等职业院校英语学习策略研究[D].湖北工业大学,职业技术教育学,2014,硕士.
[13]杨贵生.试论“依法治国”与“以德治国”相结合治国方略的意义[D].贵州师范大学,马克思主义哲学,2004,硕士.
[14]徐生.气动柔性手指的运动分析及其控制研究[D].浙江工业大学,2005.
[15]苗赛松.地铁及轻轨站台宽度计算方法探讨[J].现代城市轨道交通.2006(03)
[16]华田子.论明末清初隐逸画风[D].华东师范大学,美术学,2013,硕士.
[17]陈伟,彭文灵,杨敏.基于数据挖掘的入侵检测系统中挖掘效率的研究[J].赣南师范学院学报,2003,06:52-55.
[18]李心仪.充满活力的语言表达[D].西北师范大学,汉语言文字学,2013,硕士.
[19]由广辉.自升式钻井平台生活区域舱内结构噪声研究[D].江苏科技大学,船舶与海洋结构物设计制造,2013,硕士.
[20]刘敏芳.农产品加工企业融资问题研究[D].西北农林科技大学,2004.
[21]蒲江龙.甲醇制低碳烯烃反应动力学研究[D].华东理工大学,化学工艺,2014,硕士.
[22]张海滨.农业政策性金融对农产品加工企业的金融支持问题研究[D].安徽大学,工商管理,2012,硕士.
[23]刘瑞华.经蝶手术治疗泌乳素型垂体腺瘤的疗效分析[D].吉林大学,临床医学,2013,硕士.
[24]苏可.非英语专业口语教学研究[D].湖南农业大学,外国语言学及应用语言学,2012,硕士.
[25]李玲.食用白酒对大鼠血压、心肌细胞形态及其AT_1表达的研究[D].遵义医学院,生理学,2014,硕士.
[26]马苏艳.新型普鲁士蓝复合纳米材料在电化学生物传感器中的应用[D].青岛科技大学,2011.
[27]吴法.图像处理与机器学习在未系安全带驾车检测中的应用[D].浙江大学,2013.
[28]于晓辉.泄浊解毒、活血通络中药对糖尿病肾病大鼠肾组织中血管生成素1表达的影响[D].河北医科大学,中医内科学,2014,硕士.
[29]张静.中压架空馈线开关优化配置模型及算法研究[D].重庆大学,电气工程（专业学位）,2014,硕士.
[30]姜宝娜.中国纪录片产业化现状及发展研究[D].扬州大学,教育技术学,2012,硕士.
[31]徐敏.高校思想政治教育认同问题探究[D].首都师范大学,思想政治教育,2013,硕士.
[32]方祥云.语文启发式教学探究[D].华东师范大学,教育,2001,硕士.
[33]刘文波.全自动压药机力学问题建模及分析[D].哈尔滨工程大学,2005.
[34]蒋小莉.Tollip基因敲除对压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚及心功能影响的研究[D].华中科技大学,心血管内科,2013,硕士.
[35]嘉红云.单纯性肥胖儿童肾素血管紧张素系统与心血管疾病易患因素的关系探讨[D].山西医科大学,小儿心血管内科,2002,硕士.
[36]国艳.乌兰毛都苏木音乐生活变迁的调查与研究[D].内蒙古大学,音乐学,2014,硕士.
[37]黄璐,王洪旭,殷廷,曹九零,温成荣,宋爽.PMP-HPLC-MS分析扇贝内脏多糖的组成[J].食品工业科技.
[38]周盼盼.基于方证相应理论探讨慢性萎缩性胃炎浊毒证证治规律研究[D].河北医科大学,中医内科学,2014,硕士.
[39]李斌.SiC单晶生长设备加热系统设计及其仿真[D].西安电子科技大学,机械工程,2012,硕士.
[40]王彬,周晓庆,李笑诚,陈志敏,贺春英,吴谊群.氨基金属酞菁功能化修饰氧化石墨烯复合材料的制备及氨敏性研究[A].中国化学会.中国化学会第29届学术年会摘要集——第16分会：π-共轭材料[C].中国化学会:,2014:1.
[41]史建祥.柴油机曲轴疲劳寿命预测方法研究[D].中北大学,动力机械及工程,2013,硕士.
[42]刘茂福,曹加恒,彭敏,叶可,林芝.多媒体文本数据的模式挖掘方法[J].武汉大学学报(理学版),2001,03:321-323.
[43]吴佳乐.高效课堂理念下的创造性阅读及其教学操作[D].湖南师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[44]李明亮.XX航空公司飞行人员疲劳风险管理体系构建[D].中国民用航空飞行学院,载运工具运用工程,2013,硕士.
[45]洪春林.溶液中光敏黄蛋白发色团和二甲氨基肉桂酸的激发态氢键研究[D].大连理工大学,化学工程（专业学位）,2013,硕士.
[46]王强.水平轴风力机三维空气动力学计算模型研究[D].中国科学院研究生院（工程热物理研究所）,工程热物理,2014,博士.
[47]向孝龙.基于VxWorks的无人机快速原型仿真技术研究[D].南京航空航天大学,导航、制导与控制,2014,硕士.
[48]舒心.我国执行军事命令排除犯罪研究[D].吉林大学,军事法学,2014,硕士.
[49]梁绥东.榆林供电公司客户关系管理研究[D].兰州理工大学,工商管理,2013,硕士.
[50]唐雪梅.TGF-β_1 VEGF在儿童原发性肾病综合征中的表达及其临床意义研究[D].重庆医科大学,儿科学,2004,硕士.