番茄土传病害拮抗菌的筛选、鉴定及其防病机理初探

【摘要】番茄原产于南美洲,有较好的营养价值和经济效益。近年来,设施番茄种植面积不断扩大,高温高湿的设施环境给各种病虫害提供了有利的生长、繁殖条件,设施蔬菜病害频繁暴发,而土传病害(青枯病、枯萎病等)是影响设施番茄生产的主要病害。而使农产品产量大幅度降低,带来严重的经济损失。本文从宁夏、江苏和福建等地的连作番茄、辣椒、西瓜等作物的根际土壤中分离、筛选出对番茄青枯病和枯萎病均有防治效果的拮抗细菌,对拮抗菌株的盆栽防效和田间防效测定,检测其产生的抑菌物质,对其进行种属鉴定；并将防效最好的枯草芽孢杆菌PTS-394进行绿色荧光蛋白标记,以研究其在番茄根际土壤中的定殖动态；同时也对PTS-394的发酵培养基和培养条件进行了优化。主要结果如下：(1)从宁夏银川、江苏沭阳和福建厦门的番茄、辣椒、西瓜等作物根际土壤中,分离纯化获得367个细菌分离物。以番茄枯萎病菌和番茄青枯病菌为靶标菌,从367株分离物中筛选出对两种病菌皆具有很强拮抗作用的菌株22株。拮抗细菌抑菌物质的研究结果表明：22株拮抗细菌均能分泌蛋白酶；不能分泌几丁质酶；3株细菌能分泌纤维素酶；3株细菌能分泌嗜铁素。盆栽实验结果表明：拮抗细菌PTS-394对番茄枯萎病和青枯病的防效最高,分别为77.40%和80.00%；菌株H-70、L-1和SJ-280对番茄枯萎病和青枯病的防效均大于60%。对这四株拮抗细菌进行16srRNA种属鉴定,均为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis).(2)选择防效最好的菌株PTS-394,为研究其在番茄根际土壤中的定殖规律,本实验构建一标记菌株,即将同时携带绿色荧光蛋白基因和氯霉素抗性基因的重组质粒pGFP22以电击转入生防菌株PTS-394内,于含氯霉素平板上培养后,在荧光显微镜下观察发光菌落,得到标记菌株PTS-GFP.对标记菌株进行生长速率和抑菌活性测定,测定结果表明,菌株进行绿色荧光蛋白基因标记对其生长没有明显影响,且室内抑菌实验结果显示,标记菌株对病原菌的抑菌活性与野生菌株没有明显差异。采用灌根法接种标记菌株,以稀释分离法和Real-TimePCR测定标记菌株PTS-GFP在番茄根际土壤的定殖动态。平皿稀释法实验结果表明,PTS-GFP在灌根0-15d时呈下降趋势,15d后下降速度稍缓,至30d时可保持相对稳定,约为6.5×104cfu/g,且RT-PCR法测得的定殖动态亦呈下降趋势,此与稀释分离法测得的结果一致。(3)本实验通过Plackett-Burman实验设计及Box-Behnken设计的响应曲面法(responsesurfacemethodology,RSM)对影响生防菌株PTS-394发酵培养基配方及培养条件进行了优化。实验结果表明,使PTS-394发酵菌含量和抑菌活性最大的成分关键因子的最优配比为：玉米淀粉11.48g/L、黄豆粉13.35g/L、酵母膏0.60g/L。此时菌含量预测值为4.43×109cfu/mL,抑菌带宽为6.20mm。以优化的培养基为基础,得到最优培养条件组合为：培养温度30.84℃、初始pH6.93和装液量65.15mL/250mL时,以2%接种量,150rpm,培养时间为48h,此时发酵活菌数和抑菌带宽的最大预测值为6.32×109cfu/mL和8.24mm。
【作者】梁雪杰；
【导师】陆凡；陈志谊；
【作者基本信息】南京农业大学，植物病理学，2013，硕士
【关键词】番茄青枯病；番茄枯萎病；拮抗细菌；抗菌物质；定殖；绿色荧光蛋白标记；发酵；优化；

【参考文献】
[1]魏巍巍.高介电常数聚偏氟乙烯/金属酞菁/多壁碳纳米管复合材料的制备及性能研究[D].吉林大学,高分子化学与物理,2013,硕士.
[2]岑慧虹.试析中国南方油画山水画派的文化自觉[D].湖南师范大学,美术学,2014,硕士.
[3]郭瑞.我国金融发展对城市化的支持效应分析[D].兰州商学院,国民经济学,2013,硕士.
[4]张野,纪托.学科交叉的品牌设计教学课程体系探析[J].设计艺术(山东工艺美术学院学报),2014,04:51-54.
[5]虎良.节段拼装钢管混凝土桥墩抗震性能理论研究[D].清华大学,土木工程,2012,硕士.
[6]宋艳.CRM中基于CABOSFV改进算法的客户聚类研究[D].哈尔滨工程大学,2004.
[7]朱翠霞.《经典释文》方言词研究[D].西南交通大学,汉语言文字学,2014,硕士.
[8]王虹.论假冒注册商标罪[D].中国政法大学,法律,2004,硕士.
[9]左伟伟.贵金属纳米粒子化学发光体系检测药物的研究[D].延安大学,分析化学,2014,硕士.
[10]李水丽.单晶ZnO中杂质与缺陷的发光光谱研究[D].浙江大学,材料工程,2013,硕士.
[11]梅帅.开放式结构拓扑优化软件设计与开发[D].大连理工大学,计算力学,2013,硕士.
[12]王兆然.改良空肠间置术对SiewertⅡ/Ⅲ型食管胃结合部腺癌患者胃肠道功能的影响[D].河北医科大学,外科学,2013,硕士.
[13]樊佩.在视觉文化背景下小学生“读书感想画”的实践研究[D].上海师范大学,教育,2013,硕士.
[14]张孝法.集装箱铁水联运产品设计研究[D].西南交通大学,交通运输规划与管理,2013,硕士.
[15]类振.酸敏感离子通道与异丙酚抗伤害作用及氯喹所致非组胺性瘙痒的关系[D].山东大学,麻醉学,2014,博士.
[16]王倩蓉.基于Logistic模型的我国房地产开发投资压力测试[D].东北大学,金融学,2010,硕士.
[17]颜静.井冈山时期毛泽东党建思想研究[D].曲阜师范大学,中共党史,2013,硕士.
[18]本报记者喻思娈.我国为全球唯一实用化制造者[N].人民日报,2013-09-09012.
[19]胡蝶.自动导引车（AGV）控制系统的研究与设计[D].湖北工业大学,控制工程（专业学位）,2014,硕士.
[20]刘志平.构棘中黄酮类化合物的分离表征和二氢黄酮肟类、腙类衍生物的合成及活性研究[D].广西大学,化学工艺,2013,博士.
[21]梁微.我国网络新闻中女大学生形象及影响研究[D].西南交通大学,传播学,2012,硕士.
[22]彭莉.初中语文阅读教学从有效走向创新的策略研究[D].西北师范大学,农村教育,2013,硕士.
[23]王军玲.基于变换域的抗几何攻击图像水印技术研究[D].湖南大学,信息与通信工程,2011,硕士.
[24]吴晓霞.核心网容灾备份项目评价研究[D].东北石油大学,项目管理（专业学位）,2013,硕士.
[25]郑宏伟.中小企业融资研究[D].天津财经学院,会计学,2004,硕士.
[26]本刊编辑部.美国《科学》杂志公布2009年十大科学突破[J].中学物理教学参考,2010,Z1:17.
[27]吴笛.浙江产业技术创新战略联盟及其发展研究[D].浙江大学,2013.
[28]林璐璐,姜荣剑,徐海涛,汤一平.基于全方位视觉的自动门安全和节能检测技术[J].计算机应用,2014,06:1825-1829.
[29]罗天宽,刘斌,吴海涛,徐谦,裘波音,邹晓霞,李俊星,陈利萍.榨菜瘤状茎膨大相关基因orf451的克隆及其表达分析[J].农业生物技术学报,2015,01:32-40.
[30]曹敬静.EGCG对人肝癌细胞株HepG2细胞增殖、凋亡和侵袭的影响[D].青岛大学,营养与食品卫生学,2013,硕士.
[31]崔静.不同形貌聚吡咯的合成与表征[D].西南交通大学,材料科学与工程,2014,硕士.
[32]李登安.软法之治：和谐行政的路径选择[D].西南政法大学,行政管理,2012,硕士.
[33]刘益青,高厚磊,高伟聪.适用于数字化变电站的继电保护数据处理新方法[J].电力系统自动化,2011,15:68-72.
[34]胡肖.容隐制度在我国刑事领域的现代化[D].吉林大学,法律,2014,硕士.
[35]孙和涛.致病性大肠杆菌对动物机体免疫机能及肠道形态结构的影响[D].内蒙古农业大学,动物生产与管理,2013,硕士.
[36]葛庆峰.锦州电信“翼支付”平台功能开发[D].吉林大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[37]余青,吴必虎,廉华,童碧沙,殷平.中国节事活动开发与管理研究综述[J].人文地理,2005,06:56-59.
[38]尉秋实,王继和,李昌龙,庄光辉,陈善科.不同生境条件下沙冬青种群分布格局与特征的初步研究[J].植物生态学报,2005,04:591-598.
[39]潘雪梅.改性淀粉/天然橡胶复合材料性能的研究[D].海南大学,材料学,2014,硕士.
[40]朱津.中国股市量价关系的实证研究[D].上海大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[41]陆清清.武汉城区两所寄宿制初中学生自主管理能力调查研究[D].华中师范大学,教育管理,2013,硕士.
[42]李航,刘宗田,陈慧琼.挖掘关联规则的并行算法[J].小型微型计算机系统,2002,10:1231-1234.
[43]余敏.消费者视角下旅游景区品牌延伸评价研究[D].山东大学,企业管理,2013,硕士.
[44]韩静.纤维素纤维活性染料低盐低碱染色的工艺研究[D].武汉纺织大学,纺织化学与染整工程,2013,硕士.
[45]刘翔.辩证法理论视角下的日语存在句研究[D].扬州大学,外国语言学及应用语言学,2012,硕士.
[46]孔金平,王忠莉.非政府组织信任危机补救研究[J].行政论坛,2015,02:88-92.
[47]张艳.有氧运动改善慢性应激诱发抑郁大鼠空间学习的脑机制[D].天津体育学院,体育教育训练学,2014,硕士.
[48]陈侃.融资约束下上市公司投资与现金流敏感性关系研究[D].浙江大学,2006.
[49]李丽云.汽车驱动桥壳的力学性能仿真分析[D].湖南大学,机械工程,2012,硕士.
[50]付伟丽.滑行式刨煤机刨头随机刨削载荷谱研究[D].辽宁工程技术大学,机械设计及理论,2012,硕士.