棉铃虫EcR、USP和FTZ-F1表达规律以及功能研究

【摘要】完全变态昆虫要经过周期性的蜕皮和变态才能完成整个生活史,昆虫发育的生理活动是在一系列激素的调控下完成的。通过对昆虫蜕皮相关基因的研究,不仅可以了解昆虫的生长发育以及蜕皮的分子机理,而且在此基础上可以发现新的分子靶标,为害虫防治提供新思路。昆虫蜕皮激素受体(ecdysonereceptor,EcR)和超气门蛋白(ultraspiracle,USP)是蜕皮激素的分子靶标,处于昆虫蜕皮、变态及繁殖等生命过程级联反应的启动位置,对昆虫的生长、发育及繁殖具有重要的意义。本文利用RNAi技术以及实时定量PCR技术研究了EcR和USP基因在棉铃虫五龄、六龄幼虫的表达规律及其功能,并且研究了EcR和USP基因分别沉默后,对E74、JHE、HR3、FTZ-F1等蜕皮相关基因的影响,以确定这些基因之间的上下游关系。FTZ-F1是与果蝇同源异形蛋白FTZ(fushitarazu)以异二聚体形式发挥作用,FTZ-F1参与幼虫到幼虫的蜕皮、幼虫的化蛹以及成虫的发育过程。本文首次克隆了βFTZ-F1的中间片段,并利用实时定量PCR技术研究了该基因在棉铃虫五龄、六龄幼虫中的表达规律,利用RNAi技术研究了该基因的功能,以及FTZ-F1基因与EcR、USP、E74、JHE、HR3之间的相关关系。实时定量PCR分析EcR、USP、E74、JHE、HR3、FTZ-F1的rnRNA在棉铃虫五龄、六龄中的表达规律,结果表明这六个蜕皮相关基因在棉铃虫的五龄、六龄均有表达,呈现周期性变化。其中EcR与USPmRNA均在五龄期出现一个表达峰,六龄期出现两个表达峰,根据二者的表达峰出现的时间,发现EcR相对USP表达超前8-16h;E74在五龄与六龄期分别出现一个表达峰；JHE与HR3均是在五龄期出现一个表达峰、六龄期出现两个表达峰；FTZ-F1在五龄与六龄期均出现两个表达峰。根据各个基因的表达水平以及表达峰出现的时间,可以得出：EcR、USP、E74、HR3、FTZ-F1参与了昆虫幼虫间的蜕皮、预蛹的形成以及预蛹-蛹的发育,.JHE参与了昆虫幼虫间的蜕皮以及预蛹-蛹的发育。EcR与USP分别沉默后,发现其导致靶标基因表达下调的同时,也对其他蜕皮相关基因的表达造成一定的影响。EcR的下调,导致了E74、JHE、HR3、FTZ-F1基因一定程度的下调,说明EcR处于E74、JHE、HR3、FTZ-F1的上游,参与E74、JHE、HR3、FTZ-F1的表达；USP的下调,也导致了E74、JHE、HR3、FTZ-F1基因一定程度的下调,说明USP处于E74、JHE、HR3、FTZ-F1的上游,参与E74、JHE、HR3、FTZ-F1的表达。FTZ-F1沉默后,导致了FTZ-F1基因表达的下调,同时也对HR3的表达造成一定的影响,HR3的表达呈现上升与下降的交替变化,已有文献报道HR3参与了FTZ-F1的表达,而FTZ-F1的下调对HR3造成一定的影响,我们推测,FTZ-F1与HR3二者存在相关抑制的现象。利用RNAi研究EcR、USP与FTZ-F1的功能。将EcR沉默后,处理的五龄幼虫出现不能正常蜕皮进入六龄的异常表型,呈现蜕皮停滞状态；处理的六龄幼虫出现三种异常表型,不能正常形成预蛹、不能正常化蛹以及出现发育缺陷型蛹,说明EcR参与昆虫幼虫间的蜕皮、预蛹的形成以及预蛹-蛹的发育。将USP沉默后,出现与EcR的沉默相类似的异常表型,处理的五龄幼虫出现不能正常蜕皮进入六龄的异常表型,呈现蜕皮停滞状态；处理的六龄幼虫不能正常形成预蛹、不能正常化蛹,说明USP在昆虫幼虫间的蜕皮、预蛹的形成以及预蛹-蛹的发育等过程是必需的。将EcR与USP同时沉默后,产生了与分别沉默EcR、USP相类似的异常表型,根据定量PCR分析数据,推测USP的沉默导致了EcR表达的下调。将FTZ-F1沉默后,五龄幼虫出现不能正常蜕皮进入六龄的异常表型,呈现蜕皮停滞状态,六龄幼虫出现不能正常形成预蛹,呈现头胸部保持幼虫状态,腹足消失等异常表型,说明FTZ-F1参与了昆虫幼虫间的蜕皮以及预蛹的形成。
【作者】刘畅；
【导师】苏建亚；
【作者基本信息】南京农业大学，农药学，2013，硕士
【关键词】棉铃虫；EcR；USP；FTZ-F1；RNAi；

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