传染性法氏囊病病毒自然重配超强毒株的分离及其VP2和VP3基因的克隆表达

【摘要】传染性法氏囊病(Infectiousbursaldisease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectiousbursaldiseasevirus,IBDV)引起的以侵害雏鸡淋巴组织尤其是中枢免疫器官—法氏囊为主要特征的一种急性、高度接触性传染病。该病主要侵害机体免疫器官,造成免疫抑制,致使疫苗免疫接种失败。2004年以来,在华东地区商品代蛋鸡场和肉鸡场发生了多起IBD疫情,在流行病学与临床症状方面表现为IBD疫苗免疫失败、发病快、死亡率高。本实验室从具有该流行病学特征的病鸡法氏囊组织中分离到了两株IBDV自然重配超强毒株,分别命名为QL和ZZ-11,并对其致病力特性、全基因组序列特征进行了研究,最后对其主要结构蛋白基因VP2和VP3进行了克隆表达,并建立了IBDV抗体间接ELISA检测方法。试验内容包括：实验一：传染性法氏囊病病毒超强毒株的分离鉴定从接种过IBDVB87疫苗的发病鸡群中分离到两株传染性法氏囊病病毒(IBDV),分别命名为QL和ZZ-11。用该原始病鸡法氏囊悬液连续3次人工感染SPF鸡后,再取其法氏囊制备悬液,-70℃保存。经绒毛尿囊膜途径接种10日龄SPF鸡胚,测定鸡胚的半数致死量(ELD50)。鸡的日龄和接种剂量不同,其致死率有很大差异。对23-51日龄的SPF鸡分别接种20、200、2000个ELD50剂量的QL株和ZZ-11株病毒后,1周内死亡率均在55%以上,最高可达100%;对3-7周龄SPF鸡致死率均较高,在90%左右；对13-15周龄的SPF鸡致死率也在50%左右。死亡鸡法氏囊肿大出血,呈“紫葡萄”样外观,胸肌腿肌呈条带状出血,法氏囊／体重比较正常对照显著下降。QL和ZZ-11株的VP2基因符合vvIBDV的氨基酸特征,包括222A、256I、279D、284A、294I、299S和位于326~332位七肽基序(SWSASGS)。致死率、病理变化、组织切片分析、VP2基因特征分析都说明QL和ZZ-11是超强毒株,并且具有致死率高、直接致死鸡胚等特性。实验二：传染性法氏囊病病毒自然重配株全基因组序列分析从具有新的流行病学特征的传染性法氏囊病(IBD)发病鸡群中分离到两株传染性法氏囊病病毒(IBDV),分别命名为QL和ZZ-11,对4周龄SPF鸡的致死率分别为94%和86%。为分析该毒株的分子生物学特征,对其全基因组序列进行了测定,两个病毒株基因组A节段长度为3260bp、B节段长度2827bp。病毒演化分析结果显示两个病毒基因组A节段的核苷酸序列与已发表的超强毒株核苷酸序列的同源性为96.8%～98.1%和96.9%～98.4%,处在IBDV超强毒株分支上；而B节段与已发表的弱毒株序列的同源性分别为89.7%～90.4%和90.0%～90.7%,位于弱毒株分支上。IBDV超强毒株和弱毒株序列特征氨基酸残基与基序分析表明,QL和ZZ-11两个病毒株的A节段VP2基因的氨基酸残基为222A、249Q、253Q、254G、256I、2941和299S,七肽基序为SWSASGS,均符合超强毒株的分子特征;而B节段777-782位核苷酸序列为GGTGCC,没有KpnI酶切位点,具有弱毒株的序列特点。以上分析结果表明,QL和ZZ-11为IBDV自然重配株,A节段源于超强毒株,而B节段源于弱毒株。实验三：传染性法氏囊病病毒自然重配超强毒株VP2和VP3基因的克隆表达从IBDV自然重配超强毒株QL株的法氏囊组织中扩增出VP2和VP3结构蛋白基因,VP2具有wIBDV所特有的222A、253Q、256I、279D、284A、294I、299S和位于326～332位的七肽基序SWSASGS,并具有其它超强毒株和弱毒株都没有的127A、324R和370S氨基酸残基；VP3基因与其它超强毒株和弱毒株的核苷酸与氨基酸同源性都很高,均在97.3%以上,但也有799A、849G、931V、976D四个特异的氨基酸残基。将该VP2和VP3基因分别定向克隆入原核表达载体pET32a中,构建了原核表达质粒pET32a-VP2弄口pET32a-VP3,并转化E.coliBL21(DE3);经IPTG诱导后用SDS-PAGE分析,重组VP2融合蛋白的分子质量为67kDa,表达量约占菌体总蛋白量的30%,表达产物主要以包涵体形式存在于菌体中;重组VP3融合蛋白的分子质量为57kDa,表达量约占菌体总蛋白量的40%,表达产物主要以包涵体形式存在于菌体中；用Westernblot分析,重组VP2蛋白和重组VP3蛋白均与IBDV阳性血清发生特异性的反应;以纯化的重组VP2蛋白和重组VP3蛋白为抗原建立的IBDV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。
【作者】朱向东；
【导师】王永山；范红结；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】传染性法氏囊病病毒；自然重配；分离鉴定；全基因组序列分析；VP2和VP3基因；克隆表达；

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