猪流行性腹泻病毒分子流行病学调查及间接ELISA抗体检测方法的建立

猪流行性腹泻病毒分子流行病学调查及间接ELISA抗体检测方法的建立

作者:师大云端图书馆 时间:2018-07-18 分类:硕士论文 喜欢:4260
师大云端图书馆

【摘要】猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea,PED)是猪的一种高度接触性传染病。1978年该病病原猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)得到了首次鉴定。自2010年下半年以来,该病在我国的流行强度不断扩大,还伴有哺乳仔猪高死亡率等特点,给我国的养猪业造成了巨大的经济损失。目前,国内外还没有建立一种标准化的,能在基层推广使用的PEDV鉴别检测方法。对国内流行毒株进行进一步的流行病学调查,并建立一种快速,准确的鉴别诊断方法是了解我国PED流行状况,更好的防控该病的前提,具有重要的实践意义。本研究具体内容如下:1猪流行性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与流行病学调查针对PEDV的保守基因M建立了RT-PCR检测方法,并证实其具有较高的敏感性和特异性。用建立的RT-PCR检测方法对猪群中的PEDV流行情况进行了调查,2011年3月至2012年12月间从9个省市共24个规模化猪场采集的113份腹泻病料的检测结果显示,有20个猪场70份样品为PEDV阳性,猪场阳性率达到83.33%,样品阳性率为61.95%,说明PED在当前的腹泻疫情中任然占主导地位,在仔猪腹泻病防控过程中应该着重加强对该病的综合防控。2PEDV部分S蛋白的原核表达参考GenBank上已发表的PEDV基因序列,针对抗原位点设计引物扩增其部分S基因片段,并将该片段定向插入到pET-28a中成功构建出原核表达载体,将重组质粒转化宿主菌BL21,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳分析初步确定重组融合蛋白pET28a-S582能得以表达,并经Westernblott鉴定该蛋白具有良好的反应原性和稳定性,为诊断试剂盒及基因工程疫苗的研制提供了理论基础。3PEDV间接ELISA检测方法的建立与应用以重组的部分S蛋白作为包被抗原,建立了PEDV抗体的间接ELISA检测方法。经条件优化,确定抗原最适包被浓度为4ug/mL,37℃包被2h,最佳封闭剂为1.5%BSA,血清最佳稀释度为1:200,作用时间1h,酶标二抗最佳10000倍稀释,37℃作用30min时,底物最佳反应时间为37℃10min.同时根据统计学原理,由30份阴性血清的测定结果确定了样品的判定标准。并与TSZ公司PEDV检测试剂盒进行比较,总体符合率达94.79%,具有较好的敏感性、特异性和重复性,可用于PEDV抗体检测和流行病学调查。
【作者】汪鸣;
【导师】姚火春;
【作者基本信息】南京农业大学,预防兽医学,2013,硕士
【关键词】猪流行性腹泻病毒;RT-PCR;重组蛋白S582;原核表达;间接ELISA;

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