钾转运相关基因OsHAKα和OsKβ与水稻耐盐性的关系研究

【摘要】K+是高等植物中重要的营养元素,也是非盐生植物中最丰富的无机阳离子,在植物许多细胞过程中发挥着重要作用,参与植物细胞的渗透调节。植物钾离子转运体介导植物从土壤中积累和在不同植物组织内的K+分布,根据蛋白跨膜结构,可分为五个家族：Shaker通道、KCO通道、KUP/HAK/KT转运体、TrK/HKT转运体和K/H逆向转运体。本文研究水稻HAK转运体OsHAKα和Shaker家族的OsKβ及其在水稻耐盐中的作用。利用OsHAKα和OsKβ各自的突变体与相应野生型在盐胁迫时的表型,钾钠离子含量,死亡率,干鲜重等生理指标,研究OsHAKα和OsKβ在水稻响应盐胁迫时的作用。实验发现OsHAKα的突变体在200mmol/LNaCl浓度下,种子的发芽时间延迟、发芽率降低70%,OsKβ的突变体在一定盐浓度范围内(0-250mmol/L),种子发芽率没有明显变化。盐浓度在0-300mmol/L时,两基因突变体突变体的根长受低浓度盐溶液刺激,有一定的增长,高浓度盐处理时根长生长受抑制,在250mmoy/LNaCl浓度下根长长度是对照WT苗的50%左右,两基因突变体的苗高都受到NaCl溶液的抑制,在250mmol/LNaCl浓度苗高为对照苗的50%左右。120mmol/LNaCl浓度处理水稻苗8d,两基因的突变体死亡率比相应野生型死亡率高1.25倍左右,干重降低60%左右,鲜重降低75%左右。120mmol/LNaCl处理的0d至8d里,OsHAKα的突变体的Na+含量随着天数的增加是升高的,K+含量随天数的增加是降低的,在第8d,Na+含量是相应野生型的1.3倍,K+含量是相应野生型的75%。OsKβ的突变体的Na+和K+含量随着天数的变化不明显,但该突变体表现出比相应野生型高死亡率的明显表型。这些结果表明OsHAKα和OsKβ两个基因可能正向调节水稻抗盐害能力。研究结果为进一步研究基因功能以及作用机制提供了基础。为了进一步验证这两个基因在耐盐中的作用,我们用RNA干扰的方法。首先,选取从OsHAKα3’端开始加不同长度CDS的两段不同长度的特异性片段,从OsK/β3’端开始加一定长度CDS的基因片段,从OsKβ中间跨膜功能性区域选取特异性片段,共四段特异性片段。先利用水稻原生质体为材料,快速研究基因功能的双链RNA瞬时干扰体系,在最优化的瞬时干扰系统条件下,将四个特异性片段连接T7启动子体外转录合成的dsRNA转入水稻原生质体中,半定量RT-PCR结果显示,两个基因可以在水稻原生质体体内瞬时被干扰沉默,OsHAKα的干扰率可以达到65%,OsKβ的干扰率可以达到60%。四个片段转入原生质体可明显降低基因的表达水平。其次,经过瞬时干扰确定所选片段分别被插入表达载体pSuper1300所加入的PDK功能性内含子的两端,构建成了含有内含子发卡结构的ihpRNA表达载体,通过农杆菌介导,用转染水稻愈伤组织进行验证,经过抗性筛选和PCR检测,得到转基因阳性植株；半定量RT-PCR结果显示所获得的转基因水稻植株中,OsHAKα和OsKβ两个基因表达量下降,表明该干扰载体能够分别有效抑制OsHAKa和OsKβ基因的表达,基因的ihpRNA干扰载体构建成功,为进一步鉴定该基因的功能奠定了基础。
【作者】刘金燕；
【导师】章文华；
【作者基本信息】南京农业大学，细胞生物学，2013，硕士
【关键词】水稻钾离子转运体；OsHAKα；OsKβ；RNA干扰；

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