猪卵母细胞单精子胞浆内注射胚胎的体外生产与发育

【摘要】蛋白质供应是马拉维以及整个非洲最重要的问题之一。马拉维国土面积小,养猪业尚处于初级阶段,但发展潜力巨大。全国生猪存栏量超过3,000,000头,主要集中于农村。养猪业对于农村和城市都是重要的经济产业。猪肉消费量、生猪交易量和有机肥料是评价当地养猪业的重要指标。马拉维政府重视养猪生产,并致力于提高生猪饲养、育种和疫病控制,促进养猪生产。为提高胴体品质、产仔数和肉品数量,还开展了与外来品种的杂交育种工作。政府对非洲猪瘟等疾病进行严格防控。政策上鼓励肉品生产,控制危害人类健康的疾病,养猪主要供当地消费,剩余的用来出口。在马拉维,相比其他家畜对当地猪繁殖性能的研究很少。当地猪群因某些疫病的周期性暴发而减少,如非洲猪瘟。另一个挑战是体内外寄生虫病的爆发。这些疾病的发生会影响到各年龄段生猪的生产性能和繁殖性能,造成局部地区甚至全国范围的经济损失。猪的繁殖能力高,每年可产多胎；但有关动物遗传资源保护的资料缺乏。在马拉维,与移地保护相对应的是就地保护。研究发现移地保护更加可行,主要方法包括猪精液、卵母细胞以及胚胎的玻璃化冷冻。玻璃化冷冻即在液氮中保存精子、卵母细胞或胚胎的方法,可用于濒临灭绝的动物资源移地保护。本研究的主要目的是探讨通过胞质内单精子注射(Intracytoplasmicsperminjection,ICSI)技术进行猪胚胎体外生产的移地保护方法,以保护马拉维当地猪种质资源。ICSI是一种常见的辅助生殖技术,通常应用于体外生产哺乳动物胚胎。在本试验中,从屠宰场采集母猪卵巢,进而生产体外受精(IVF)、ICSI及体细胞核移植(SCNT)胚胎。卵母细胞采自直径2-5mm的非闭锁卵泡,精子采用解冻的猪冻精。试验分为两部分：本试验的第一部分是采用不同培养液对卵母细胞和胚胎进行体外培养。首先通过体外培养观察研究卵母细胞质量对成熟的影响。成熟培养液为PZM-3添加0.57mM半胱氨酸、1mMcAMP、5μg/mL胰岛素、50μmβ-巯基乙醇、10IU/mL孕马血清促性腺激素(PMSG)、10IU/mLhCG及10%pFF(vol/vol)。结果表明,A、B组卵母细胞成熟率明显高于C组(73.3%和63.3%对36.1%；P<0.05)。然后通过ICSI方法生产胚胎并培养至卵裂和囊胚阶段,进一步检验卵母细胞质量对其发育能力的影响。胚胎培养液为PZM-3,添加0.4%BSA,75μg/mL青霉素和50μg/mL硫酸链霉素。结果表明,A组卵裂率为73.3%,明显高于B组(64.1%)和C组(51.6%)。表明卵母细胞质量对后期发育的卵裂率和囊胚率具有显著影响(P<0.05)。C组因卵母细胞质量差,未获得囊胚发育。将重构胚置于不同电场强度下激活以观察对卵裂和囊胚发育率的影响,B组(1.4Kv/cm)卵裂率为77.5%,其次是A组(1.3Kv/cm,76.9%)和C组(1.5Kv/cm,73.7%),A、B、C组囊胚率分别为7.7%,15.0%和13.2%。三组间卵裂率差异不显著(P>0.05),但B、C组囊胚率要显著高于A组(P<0.05)。分别用NCSU-23和PZM-3培养液,比较不同培养液对ICSI胚胎发育的影响。PZM-3中添加0.57mM半胱氨酸、1mMcAMP、5μg/mL胰岛素、50μMβ-巯基乙醇、10IU/mLPMSG、10IU/mLhCG和10%(v/v)pFF。PZM-3组卵裂率(71.1%)高于NCSU-23组(62.5%)；且囊胚率(10.9%)也较NCSU-23组高(2.9%),说明PZM-3较NCSU-23更有利于ICSI胚胎培养。单独使用PZM-3与添加50nMTSA相比,卵裂率分别为77.8%和25.9%。对ICSI、IVF、PA和SCNT生产的胚胎发育情况进行比较发现,IVF组卵裂率(77.8%)和囊胚率(19.4%)较高,其次为SCNT组(72.94%和16.47%)、ICSI组(72.7%和16.9%)和PA组(66.0%、17.02%),表明不同体外生产方法所获胚胎的发育能力不同,但各组卵裂率和囊胚发育率无统计学差别。本试验的第二部分是评估PZM-3添加50nMTSA对猪ICSI胚胎发育能力的影响。单独使用PZM-3与添加50nMTSA培养ICSI胚胎的卵裂率均为55%。PZM-3组的囊胚率(13.3%)高于TSA组(8.6%),但差异不显著。添加25nMTSA时,PZM-3组的卵裂率和囊胚率(77.8%和25.9%)均高于TSA组(70.4%和18.5%),但差异也不显著(P>0.05)。而添加50nMTSA时的SCNT胚胎卵裂率和囊胚率(69.39%和25.51%)高于PZM-3组(72.94%和16.47%)。比较Aurora-A基因在不同胚胎中的表达发现,IVF胚胎的表达显著高于ICSI胚胎；IVF胚胎在12和16h的表达量均较高,而ICSI胚胎在16h的表达量降至最低。本试验的结果表明,质量对猪卵母细胞和胚胎的发育能力具有积极的影响；ICSI和IVF技术结合采用PZM-3培养液是体外生产猪胚胎的适当选择。
【作者】SOZASPARKSJONGOLOLOSOZA；
【导师】芮荣；
【作者基本信息】南京农业大学，临床兽医，2013，硕士
【关键词】猪；胞质内单精注射；胚胎；体外生产；体外发育；

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