猪嗜血支原体MSG1蛋白与猪红细胞膜蛋白相互作用的研究

【摘要】猪嗜血支原体(Mycoplasmasuis,M.suis)是猪附红细胞体病(PorcineEperythrozoonosis,PE)的病原体,该病原是一类无细胞壁、嗜血液寄生的多形态微生物,临床上可以引起猪的热性、溶血性、散发性传染病,并以高热、贫血、黄疸等为主要特征,一般呈不显性感染,多在应激因素作用下发病。猪嗜血支原体病在全球分布广泛,给养猪业带来了严重的经济损失。目前,M.suis还不能在体外培养,而且对该病原感染红细胞的致病机制还不清楚。MSG1蛋白是猪嗜血支原体的一种重要的表面黏附蛋白,M.suis通过其表面黏附蛋白和红细胞的吸附是发挥致病作用的第一步,因此,探索与MSG1蛋白相互作用的红细胞膜蛋白具有非常重要的意义。本研究具体内容如下：1.猪嗜血支原体表面黏附蛋白MSG1相关红细胞膜蛋白的筛选与鉴定首先提取健康猪红细胞膜蛋白,然后应用原核表达的M.suis重组MSG1蛋白(His-tag)采用亲和层析方法,将重组MSG1蛋白和猪红细胞膜蛋白依次结合到Ni-NTA亲和层析柱上,通过洗涤杂蛋白后,最后洗脱与重组MSG1蛋白结合的红细胞膜蛋白。SDS-PAGE电泳后对捕获的三条蛋白条带切胶进行质谱分析,质谱分析结果显示这三种红细胞膜蛋白分别是猪乳转铁蛋白(Lactotransfferrin,LTF),肌动蛋白(p-actin)和带3蛋白(Band3).2.红细胞膜蛋白多克隆抗体的制备及鉴定通过基因合成方法合成了LTF全基因(2115bp),以此合成基因为模板扩增出LTF全基因N端762bp碱基(LTF-N762).将PCR扩增出的基因片段连接到pET-32a(+)原核表达载体中,构建了重组质粒pET-32a-LTF-N762.用IPTG诱导进行蛋白表达,SDS-PAGE结果显示两个重组表达菌株均表达了高水平的重组蛋白32a-LTF-N762-以原核表达纯化的重组蛋白采用背部多点皮下注射方法分别免疫小鼠和家兔,间隔两周免疫一次,第三次免疫后通过间接ELASA方法测定抗血清效价,32a-LTF-N762蛋白小鼠和家兔的抗血清效价分别为1：102400、1：51200。Westernblot结果证明这两种抗血清均能与重组蛋白发生特异性反应。用KLH偶联的小肽(band3:CGPEDPHIDYNQLGR)制备band3兔多克隆抗体,免疫和检测方法同上,间接ELASA结果显示抗体效价达到1：512000；β-actin抗体来自商品化兔多抗。用LTF、Band3和β-actin三种兔多抗分别鉴定健康猪红细胞膜蛋白,Westernblot实验结果显示这三种抗体均能与红细胞膜蛋白发生特异性反应；间接免疫荧光实验(IFA)结果显示红细胞边缘均出现特异性绿色荧光,证明了本研究通过亲和层析法筛选的红细胞膜蛋白均存在红细胞膜上。3.猪嗜血支原体MSG1蛋白与红细胞膜蛋白相互作用的分析用纯化的猪嗜血支原体重组MSG1蛋白和已制备的MSG1单克隆抗体(1A7)在红细胞和哺乳动物细胞上分别进行间接免疫荧光实验,结果证明重组MSG1蛋白能够与红细胞和哺乳动物细胞发生特异性吸附。激光共聚焦实验结果证明MSG1蛋白能分别与LTF、Band3和β-actin三种蛋白共定位在红细胞膜上。此外,本研究设计并合成β-actinsiRNA片段,在哺乳动物细胞水平进行siRNA干扰,实验结果证明了MSGl蛋白与β-actin的特异性相互作用。综上所述,本研究筛选了与猪嗜血支原体表面黏附蛋白MSG1相关的三种猪红细胞膜蛋白,并制备了LTF和Band3蛋白兔多克隆抗体,进一步分析了MSG1蛋白与LTF、band3和β-actin三种蛋白的相互作用,为研究猪嗜血支原体感染红细胞的致病机制奠定了基础。
【作者】马培培；
【导师】李玉峰；
【作者基本信息】南京农业大学，预防兽医学，2013，硕士
【关键词】猪嗜血支原体；MSG1蛋白；红细胞膜蛋白；相互作用；

【参考文献】
[1]贾萍.北京主要河流湿地近十年环境变化研究[D].首都师范大学,自然地理学,2004,硕士.
[2]王凯.MIM隧道结发光性能及电流—电压特性的研究[D].南京邮电大学,光学工程（专业学位）,2013,硕士.
[3]刘新伟.甘肃暴雨天气气候特征及其成因研究[D].兰州大学,气象学,2013,硕士.
[4]侯磊.雨花石公安分局网络安全平台的设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2012,硕士.
[5]辜长庆.鱼雷辐射噪声控制[J].舰船科学技术.1992(03)
[6]李至成.明胶系统中磷酸钙仿生矿化的研究[D].浙江大学,材料科学与工程,2013,硕士.
[7]杨蕾.cdma2000系统物理层设计与功率控制算法的研究[D].天津大学,信号与信息处理,2004,硕士.
[8]汤莉燕.高等学校经营成本核算问题研究[D].首都经济贸易大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[9]董丽.紧凑型LED配光设计中光源模拟可靠性研究[D].中国科学院研究生院(长春光学精密机械与物理研究所),光学工程,2013,硕士.
[10]徐健.生物农药推广过程中农民决策行为的实证研究[D].中国农业大学,种植业,2004,硕士.
[11]赵丽.海南森林落叶层蜘蛛的分类研究（蜘蛛目：卵形蛛科，拟平腹蛛科）[D].沈阳师范大学,动物学,2014,硕士.
[12]许兰.信息化管理背景下的军队档案远程服务研究[D].华中师范大学,图书馆学,2013,硕士.
[13]许文梅.任务型阅读与高中英语学生附带性词汇习得研究[D].华中师范大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[14]闫龙英.我国利率政策对房地产价格的影响研究[D].中北大学,技术经济及管理,2013,硕士.
[15]张娱.政府行为对中国公办大学权力结构的影响研究[D].西北大学,行政管理,2014,硕士.
[16]胡飞宇.安庆铜矿特大型采场充填体稳定性数值模拟研究[J].有色金属(矿山部分).2006(03)
[17]郑丕涛.星载压缩编码器结构优化设计[D].西安电子科技大学,机械工程,2012,硕士.
[18]周慧.L&Z证券公司全面预算管理体系设计与实施[D].吉林大学,工商管理,2012,硕士.
[19]胡际平.现代地下采矿方法典型实例(十)——大直径深孔阶段空场法[J].国外金属矿山.1990(10)
[20]毛欣欣.公安机关群体性事件应急处置机制研究[D].华南理工大学,法律（专业学位）,2012,硕士.
[21]宋向超.存在主义视角下的《追风筝的人》[D].河北师范大学,英语语言文学,2012,硕士.
[22]蒋飞.高速列车作用下路基振动响应与传播特性的试验研究[D].西南交通大学,岩土工程,2012,硕士.
[23]杨青春.吉长热电有限公司供应链合作伙伴关系管理研究[D].吉林大学,工业工程,2012,硕士.
[24]曹江.锂离子电池用PVDF-HFP基纳米复合聚合物电解质的研究[D].中南大学,材料科学与工程,2014,博士.
[25]赵琦.X射线实时成像检测管外扫查器研究[D].东北石油大学,机械工程（专业学位）,2013,硕士.
[26]刘振宇.新型多孔碳材料的合成与应用研究[D].北京化工大学,2013.
[27]朱向荣.小学生学业情绪的初步研究[D].湖南师范大学,发展与教育心理学,2013,硕士.
[28]李明廓.葵花籽油制备生物柴油工艺的研究[D].吉林农业大学,生物化学与分子生物学,2012,硕士.
[29]肖文惠.中古时期赵郡李氏家族宗教信仰研究[D].曲阜师范大学,专门史,2013,硕士.
[30]解慧.城市轨道交通车站疏散能力瓶颈识别及仿真研究[D].北京交通大学,系统工程,2013,硕士.
[31]郭士勤.我国生态农业的理论与实践[J].中国人口.资源与环境.1992(04)
[32]郭清化.基于CdS纳米粒子的核壳结构光催化剂的制备与应用[D].安徽大学,高分子化学与物理,2014,硕士.
[33]韩和亮.我国农村小额信贷法律问题研究[D].河北经贸大学,经济法学,2012,硕士.
[34]薛海山.疏水阀的选择与安装[J].北京节能.1991(01)
[35]邓泉沩.诱发道德情绪、移情能力与卷入程度对个体亲社会行为倾向的影响[D].湖南师范大学,应用心理（专业学位）,2014,硕士.
[36]丁群.银行信用卡反欺诈管理研究[D].山东大学,工业工程（专业学位）,2012,硕士.
[37]王友启.小菜蛾氨肽酶N2和ABC转运蛋白C2在Cry1Ac抗性中的作用[D].南京农业大学,农业昆虫与害虫防治,2013,硕士.
[38]黄慧,边馥苓.智能公交系统中的关键技术及其实现[A].中国地理信息系统协会.中国地理信息系统协会第三次代表大会暨第七届年会论文集[C].中国地理信息系统协会:,2003:4.
[39]周春晓.论地方人大财政监督权行使方式的完善[D].苏州大学,法律（专业学位）,2013,硕士.
[40]于鼎杰,郭冰,顾小芳,郭登峰,储富强.聚苯并咪唑/两性离子修饰氧化石墨烯复合质子交换膜的制备与表征[J].常州大学学报(自然科学版),2013,04:69-73.
[41]马琳,叶剑波,黄国创,王臻,周鑫发,武敏,陈卫祥.SnS_2-SnO_2/石墨烯复合材料的合成及其电化学储锂性能的研究[J].表面技术,2015,01:8-14.
[42]郭双生,魏小东,陈波,张大伟.不规则盐岩层发育区下伏构造精细解释——以北特鲁瓦油田为例[J].石油地球物理勘探,2012,S1:91-96+167+162.
[43]李晶.镁离子电池钒系正极材料的研究[D].重庆大学,化学,2014,硕士.
[44]舒文华.服务城市经济和社会发展努力提高标准化工作有效性[J].上海标准化.2005(03)
[45]朱衍镛.波在PTL介质中传播的旅行时反演[J].石油地球物理勘探,1991,03:319-327+408.
[46]记者戈清平.石墨烯材料电池技术获新突破[N].中国高新技术产业导报,2011-09-26C04.
[47]李军.九阳生物人力资源战略研究[D].兰州理工大学,工商管理,2013,硕士.
[48]张纯,宋彦.美国城市精明增长策略下的暴雨最优管理经验及启示[J].国际城市规划,2015,02:75-80.
[49]邓甦,唐恒永.高校科研决策支持系统中关联规则挖掘的应用[J].沈阳师范大学学报(自然科学版),2004,01:7-11.
[50]俞晓军.物流外包服务商选择研究[D].浙江工业大学,2009.