牛传染性鼻气管炎病毒全基因测序和gE基因缺失株的构建及鉴定

牛传染性鼻气管炎病毒全基因测序和gE基因缺失株的构建及鉴定

作者:师大云端图书馆 时间:2017-10-12 分类:硕士论文 喜欢:2117
师大云端图书馆

【摘要】牛传染性鼻气管炎病毒(InfectiousBovineRhinotracheitisVirus,IBRV),又名牛Ⅰ型疱疹病毒,坏死性鼻炎病毒,能够侵袭牛的多种组织器官,具有广泛的嗜性,可以引起多种临床疾病如牛传染性鼻气管炎、子宫炎、外阴阴道炎等,有些引起肺部继发性感染会造成致死。病毒感染成年牛后,造成母牛的产奶量下降和流产,肉用牛的成长减缓;对于感染后痊愈的牛,仍有继续排毒的可能,对易感牛群有着潜在的威胁。近年来,该病在我国已逐渐呈现流行蔓延趋势,对我国养牛业造成极大的损失,因此对本病进行研究有着极为重要的意义。牛传染性鼻气管炎病毒属于双股线性DNA病毒。DNA总长约130Kb,其中包含一个长独特区,一个短独特区和两个反向重复序列。该病毒因短独特区的翻转异构而存在两种异构体,此外,反向重复序列中的基因变异较明显。将本实验室分离得到的牛传染性鼻气管炎病毒GD0109在牛肾细胞(MDBK)中扩增培养,之后,使用酚-氯仿抽提的方法提取得到分离株病毒的基因组,用高通量测序得到有意义的分离群(Contig)20个,将其与参考株Bovineherpesvirustype1.1completegenome(GenBank:AJ004801.1)进行比对分析和拼接,发现分离群间有未测通部分,根据测得序列继续设计引物扩增未测通的区域并测序,对分离群间的gap进行修补,进而得到尽量完整的基因组序列。比对分析发现分离株病毒与已公布的序列均不完全相同,说明分离得到一株新的牛传染性鼻气管炎病毒毒株,对于研究该病毒的变异程度和研制针对不同毒株的新型疫苗打下基础。本研究经过分析发现分离株病毒与参考序列同源性高达90%以上,但仍有部分片段如反向重复序列中变异十分明显,说明这个区域容易发生变异,而本试验中分离得到的牛传染性鼻气管炎病毒是一个新的毒株,很有必要进行研究。目前对于牛传染性鼻气管炎的防制没有十分有效的办法,主要依靠疫苗进行预防,新型疫苗现在发展迅速。第一种DNA疫苗就是针对本病的新型疫苗;随即还有对IBRV病毒进行毒力基因的缺失制作的基因缺失疫苗;还有将本病毒当做载体表达外源基因制成的重组活载体疫苗等。本试验根据测得的分离株牛传染性鼻气管炎病毒(GD0109)序列设计引物,扩增得到gE基因两条同源臂,并根据pIRES-EGFP质粒的序列设计引物,使用融合PCR的方法扩增得到CMV-EGFP筛选标记基因;分别将上述片段连接至pUC19载体,得到转移质粒pUC-gEE。之后将质粒转染入接种了分离株病毒的MDCK细胞,用同源重组的方法获得并纯化出重组病毒gE缺失株,命名为rIBRV-A7。本试验通过对重组病毒TCID50的测定,滴度由重组前的106.7下降到了1056,通过空斑形成单位的测定及空斑大小的测量发现重组病毒的空斑直径小于亲本毒株,差异显著,证实了gE缺失毒株毒力下降。通过对重组病毒生长曲线的绘制、遗传稳定性试验证实了本重组病毒稳定性好,不易发生突变。重组前后的病毒分别免疫小鼠,并采血制备免疫血清进行交叉中和试验,发现重组毒制得的血清对亲本毒的中和效价以及亲本毒制得的血清对重组毒的中和效价都达到了27,说明本研究构建的重组病毒有着良好的免疫原性。综合以上几点确定了本重组病毒具有良好的稳定性和免疫原性,并且病毒毒力有所下降,充分说明本试验构建的重组病毒用于制备疫苗的可能性。
【作者】吴文浩;
【导师】姚火春;
【作者基本信息】南京农业大学,预防兽医学,2013,硕士
【关键词】牛传染性鼻气管炎病毒;测序;同源重组;病毒特性;

【参考文献】
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