苏、鲁、川地区禽坦布苏病毒病的流行情况调查及三重抗体ELISA方法的建立

【摘要】为了解坦布苏病毒病在我国家禽类中的流行情况,应用间接ELISA方法对江苏、山东、四川的鸭、鸡和鹅进行了抗坦布苏病毒抗体测定,并对可疑病例的病料进行了病毒分离。2012年5月至2013年1月江苏省抗体阳性率为78.5%(142/181),四川省抗体阳性率为0(0/40)。其中抗体阳性地区绍兴鸭(蛋鸭)的抗体阳性率为90.9%(100/110),枫叶鸭(种鸭)为65.6%(40/61),樱桃谷鸭(种鸭)为20%(2/10)。通过对南京某鸭群多次抗体检测结果表明,5月和次年1月抗体水平较低,9月抗体水平较高,5月到9月份抗体水平呈升高趋势,9月到次年1月呈下降趋势。2012年10月至2013年1月江苏部分地区的84份鸡血清(卵黄)抗坦布苏病毒抗体总体阳性率为57.1%(49/84)。溧阳抗体阳性率为84.6%(11/13);南京抗体阳性率为57.7%(15/26);镇江抗体阳性率为51.1%(23/45)。蛋鸡的抗体阳性率为66.7%(26/39),肉鸡的抗体阳性率为51.1%(23/45)。应用套式RT-PCR方法检测10份肉鸡可疑病料,结果病原阳性率为0(0/10)。应用酶标鸭二抗间接ELISA方法对2012年6月至2013年3月采集的江苏、山东、四川的317份鹅血清进行测定,江苏抗体阳性率为55.8%(144/258);山东抗体阳性率为23.1%(9/39);四川抗体阳性率为0(0/20)。抗体阳性地区肉鹅的抗体阳性率为75.5%(102/135)；种鹅抗体阳性率34.1%(42/123);朗德鹅抗体阳性率为23.1%(9/39)。应用套式RT-PCR方法检测43份肉鹅可疑病料,结果病原阳性率为4.65%(2/43),通过接种鸡胚获得2株坦布苏病毒,病毒NS5部分基因测序结果表明,2个毒株与近年分离的禽坦布苏病毒同源性均在99%以上。用提取的鹅IgG免疫绵羊,三次免疫后,当抗鹅抗体达到较高滴度时进行采血,辛酸硫酸铵法提取羊血清中的抗鹅IgG抗体,纯化后用于ELISA方法检测鹅血清中的抗坦布苏病毒抗体。该ELISA方法的程序是以纯化的重组E蛋白作为包被抗原,加入鹅血清,再加入自制的羊抗鹅二抗,最后加入酶标兔抗羊抗体,加入底物显色。通过对试验条件进行优化,确定最佳抗原包被浓度为4μg/ml,抗原包被最适条件为4℃包被过夜；血清抗体最佳稀释度为1：28；羊抗鹅二抗最佳稀释倍数为1：400,最佳作用时间为2h;三抗最佳稀释倍数为1：8000,最佳作用时间为1h;结果判定采用以X+3SD为阴阳性临界值的判定标准。测定了该方法的敏感性和可重复性。应用建立的ELISA方法检测了80份采自山东和江苏的鹅血清,结果显示抗体总阳性率为65%(52/80)。而用鸭二抗ELISA方法检测的抗体阳性率为52.5%(42/80),两种方法阳性符合率为80.8%(42/52),阴性符合率为73.7%(28/38)。
【作者】游园；
【导师】李祥瑞；李银；
【作者基本信息】南京农业大学，兽医公共卫生，2013，硕士
【关键词】坦布苏病毒；流行情况；鸡；鸭；鹅；

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