山羊耳尖成纤维细胞重编程为多能干细胞的研究

山羊耳尖成纤维细胞重编程为多能干细胞的研究

作者:师大云端图书馆 时间:2016-09-13 分类:硕士论文 喜欢:1298
师大云端图书馆

【摘要】2006年,诱导多能干细胞(Inducedpluripotentstemcells,iPSCs)被日本东京大学的Takahashi和Yamanaka发现,由于其与胚胎干细胞(EmbryonicStemCells,ES)存在相似的自我更新和分化潜能,且不涉及伦理问题。因此,在临床治疗等方面具有广阔的研究前景并迅速成为当前研究的热点。本试验以山羊为材料分离山羊耳尖成纤维细胞(Goatearfibroblast,GEF),并通过多顺反子慢病毒系统和可诱导慢病毒系统尝试重编程GEF为山羊iPS细胞,优化山羊iPS细胞的诱导方法。结果如下:1.通过组织块贴壁法成功分离得到GEF,通过酶消化法分离C57/BL6小鼠胚胎成纤维细胞(MouseEmbryonicFibroblast,MEF)。丝裂霉素C处理MEF和GEF,制备饲养层。2.慢病毒载体与包装载体共转293t细胞,进行慢病毒包装,48h后,荧光显微镜下可见绿色荧光表达,收集慢病毒上清液并测定滴度。多顺反子慢病毒plentG-KOSM滴度为105~6TU/ml,用Millipore的100KD浓缩柱使其滴度达到106~7TU/ml;而可诱导慢病毒系统包装病毒的滴度为106~7TU/ml。3.两套慢病毒系统分别感染GEF,在不同饲养层条件下进行诱导培养,结果显示,只有在MEF作为饲养层的条件下诱导得到疑似iPS克隆,且只有可诱导慢病毒组获得可以增殖的疑似山羊iPS克隆。4.山羊iPS细胞生物学特性检测:1)对得到的疑似山羊iPS细胞进行碱性磷酸酶染色及Tra-1-60,Tra-1-81,REX-1和SSEA-1免疫荧光染色,染色结果均呈阳性。2)提取疑似山羊iPS细胞RNA,RT-PCR检测一些相关的ES细胞标记基因,发现其表达Rexl、CDH1、Dnmt3b、TDGF,内源性Sox2及Oct4。3)对多能基因Nanog启动子区甲基化状态进行分析,结果表明Nanog基因启动子在山羊iPS细胞中大多数处于低甲基化状态,而在GEF中绝大多数处于高甲基化状态。4)在体外可形成拟胚体(Embryoidbody,EB),EB能自分化为各个类型细胞且表达三胚层标志性基因Fibronectin(外胚层)、Enolase3(中胚层)、AFP(内胚层)。5)将5×106个山羊iPS细胞分别注射到4只NOD/SCID小鼠皮下和后腿肌肉内,在体内可形成向三个胚层分化的畸胎瘤。表明得到的山羊iPS细胞具有多能性。
【作者】彭静;
【导师】蒋思文;
【作者基本信息】华中农业大学,动物遗传育种与繁殖,2014,硕士
【关键词】转录因子;饲养层;干细胞表面标记基因;免疫荧光染色;山羊耳尖成纤维细胞;诱导多能干细胞;

【参考文献】
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