小鼠FcRn介导转运禽流感抗原的粘膜免疫研究

【摘要】高致病性禽流感不仅对养禽业造成了巨大的经济损失,而且也感染人,严重威胁人类的健康。禽流感病毒主要通过粘膜感染人体,因此预防禽流感最理想的免疫途径就是通过粘膜免疫,因为皮下或肌肉注射一般只引起非常微弱的粘膜免疫反应,而通过粘膜免疫接种模拟了病毒的自然感染途径,可以同时产生有效地局部粘膜免疫反应和全身性的系统免疫反应。鉴于FcRn可以介导IgG跨越粘膜屏障,我们以小鼠为模型设计禽流感H5N1HA1与小鼠IgGFc片段融合,模拟FcRn介导IgG转运的胞转通路开展了禽流感的粘膜免疫研究。在本课题组的前期研究中,已构建了原核表达重组质粒KG-HA1,pET-32a-HA1-wFc与杆状病毒真核表达重组质粒pFASTBACHTb-sHA1-wFc和pFASTBACHTb-sHA1-mFcoHA1-wFc是HA1和IgG2aFc野生型片段的融合基因,sHA1-wFc是加了信号肽的HA1和IgG2aFc野生型片段的融合基因,sHA1-mFc是sHA1和IgG2aFc突变型片段的融合基因。本研究主要成果如下：1.表达并纯化了四种HA1融合蛋白：GST-HA1,His-HA1-wFc(原核表达),His-sHA1-wFc(真核表达,简称sHA1-wFc)和His-sHA1-mFc(真核表达,简称sHA1-mFc)。其分子量分别为62KDa,87KDa,72KDa和72KDa。2.在IMCD-rFcRn细胞系的体外胞转模型中,FcRn能介导sHA1-wFc融合蛋白从细胞的顶端侧转运到基底膜端侧,而sHA1-mFc融合蛋白和His-HA1-wFc融合蛋白均不能被胞转；在体内sHA1-wFc融合蛋白能有效的跨越小鼠呼吸道粘膜上皮进入血液中,与sHA1-mFc和GST-HA1融合蛋白进入小鼠血液中的量相比差异极显著(P<0.01)。3.sHA1-wFc融合蛋白经滴鼻免疫既能诱导有效的粘膜免疫反应,又能诱导全身性免疫反应：(1)二免后第10d在sHA1-wFc滴鼻免疫组小鼠的气管与肺脏冲洗液中,SIgA的ELISA抗体效价分别为1：117和1：64,IgG的ELISA抗体效价分别为1：298和1：462,与其它滴鼻免疫组相比差异极显著(P<0.01)。而sHA1-wFc皮下免疫组SIgA的ELISA抗体效价分别仅为和1：10和1：13,IgG的ELISA抗体效价均为1：58。sHA1-wFc滴鼻免疫组与皮下免疫组相比差异极显著(P<0.01)。用HI法没有检测到IgG抗体效价。(2)二免后第14dsHA1-wFc滴鼻免疫组IgG的ELISA抗体和HI抗体水平最高,ELISA抗体效价达到1：9386,HI抗体效价达到1：46,与其它滴鼻免疫组相比差异极显著(P<0.01)；同样,在二免后第14dsHA1-wFc皮下免疫组IgG的ELISA抗体和HI抗体水平最高,ELISA抗体效价达到1：18773,HI抗体效价达到1：80,与sHA1-wFc滴鼻免疫组相比差异极显著(P<0.01)。(3)二免后第10dsHA1-wFc滴鼻免疫组血清中IFN-γ和IL-2含量分别达到330pg/mL和106pg/mL,与其它滴鼻免疫组相比差异极显著(P<0.01)。sHA1-wFc皮下免疫组血清中IFN-γ和IL-2含量分别达到178pg/mL和72pg/mL,sHA1-wFc滴鼻免疫组与皮下免疫组相比差异极显著(P<0.01)。(4)二免后第10dsHA1-wFc滴鼻免疫组小鼠脾细胞增殖指数为1.14,与其它滴鼻免疫组差异极显著(P<0.01)。sHA1-wFc皮下免疫组小鼠脾细胞增殖指数为1.36,与sHA1-wFc滴鼻免疫组相比差异显著(P<0.05)。(5)攻毒后第3d在sHA1-wFc免疫组(滴鼻或皮下注射)的肺脏中均未检测到病毒的血凝活性,而在其它免疫组肺脏组织中均检测到了病毒的血凝活性；HA1-wFc免疫组(滴鼻或皮下注射)体重下降不明显,且很快恢复到正常体重,而其它免疫组小鼠体重下降明显,下降幅度最高达25%；sHA1-wFc免疫组(滴鼻或皮下注射)攻毒保护率均为100%,而sHA1-mFc和His-HA1-wFc滴鼻免疫组小鼠保护率分别仅为40%和20%,空白对照组小鼠全部死亡。sHA1-wFc融合蛋白辅以CpGODN1826粘膜佐剂通过滴鼻免疫,利用FcRn介导的IgG胞转通路能有效的转运禽流感抗原跨越小鼠呼吸道粘膜屏障进入体内,既能诱导有效的粘膜免疫反应,又能诱导全身性免疫反应,能完全保护免疫小鼠抵抗致死性禽流感病毒的攻击。
【作者】党威；
【导师】李自力；
【作者基本信息】华中农业大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】H5N1HA1；sHA1-wFc；FcRn；滴鼻免疫；IgG胞转作用；

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