副猪嗜血杆菌dsbA基因缺失株的构建及功能研究

【摘要】副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)是猪体内一种条件致病菌,定植在猪上呼吸道,可以引起以浆液性纤维素性渗出为主要病理变化的关节炎、脑膜炎等,但是关于副猪嗜血杆菌主要的毒力因子及其致病机制尚不十分清楚。dsbA基因编码一种二硫键折叠酶,在许多分泌蛋白及外膜蛋白的正确折叠及准确定位过程中发挥重要作用。为了研究dsbA基因在副猪嗜血杆菌致病过程中发挥的主要功能,本实验构建了dsbA基因缺失突变株来研究其在粘附、抵抗吞噬细胞杀伤过程中发挥的主要作用。1构建pK18-D1K、pK18-D2E重组质粒根据SH0165全基因组序列设计引物扩增CF7066中dsbAl、dsbA2基因上下游同源臂及kan、erm抗性盒,并在上下游同源臂的两端加上USS序列。通过重叠PCR将dsbAl、dsbA2基因的上下游同源臂及相对应的抗性盒进行连接,对重组片段和pK18mobsacB质粒载体进行相同的双酶切,并用T4Ligase进行连接转化后转入大肠杆菌DH5α。长出的转化子进行鉴定,得到了pK18-D1K,pK18-D2E重组质粒且没有任何碱基突变。2dsbAl、dsbA2单基因缺失株及双基因缺失株的构建用重组质粒pK18-D1K、pK18-D2E依次与HPS进行自然转化,得到了含有kan抗性的dsbAl基因缺失株、含有erm抗性的dsbA2基因缺失株。在此基础上,用pK18-D2E自然转化含有kan抗性的dsbAl基因缺失株,筛选并得到了含有kan和erm抗性dsbAl、dsbA2双基因缺失株。3基因缺失株的鉴定普通PCR扩增16SrRNA、抗性盒、目的基因初步验证得到了基因缺失株；用同一引物分别对野生菌株及缺失株进行扩增,并通过Blast序列比对结果表明确实发生了抗性盒与目的基因dsbA的等位替换；用设计的目的基因及抗性盒内部引物对野生菌株和基因缺失株的cDNA进行扩增,结果表明目的基因不能表达而抗性盒基因可以表达。用目的基因对应的上下游基因的内部引物对各基因缺失株的cDNA进行扩增,证明得到的缺失株没有产生极性效应。4dsbA基因功能研究通过绘制野生菌株及各基因缺失株OD600-时间曲线,证明了dsbA1、dsbA2单基因及双基因缺失株与野生菌株相比没有差别,且相同OD600值对应的活菌数也基本一致。同时进行了细菌与细胞作用后,用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试剂盒对培养上清中的LDH活性进行检测,来研究dsbA基因缺失后对细胞毒性的影响。通过对PK-15细胞和RAW细胞毒性实验发现,dsbA1基因在对RAW细胞毒性作用中发挥主要作用,且该细胞毒性作用在体细胞PK-15中没有体现。细菌的粘附实验表明dsbAl、dsbA2基因缺失后均表现为对PK-15细胞的粘附能力增强,其中dsbA2基因在粘附功能中发挥的作用强于dsbA1基因。进一步的吞噬实验结果显示dsbAl、dsbA2基因缺失以后均表现为抵抗RAW细胞吞噬能力减弱,dsbA2基因缺失以后还表现为吞噬细胞内的存活能力明显下降。此外,对单基因及双基因缺失株的总糖含量进行了检测,通过检测基金缺失株及野生菌株的主要毒力基因表达情况,发现dsbAl单基因缺失株及双基因缺失株中wza基因表达下调分别为23.2和22.7倍。经过细菌总糖提取及SDS-PAGE电泳检测后发现,双基因缺失株糖含量稍多于其他菌株,其余菌株之间差异不明显。
【作者】李兰颖；
【导师】蔡旭旺；
【作者基本信息】华中农业大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】副猪嗜血杆菌；基因缺失株；粘附；细胞毒性；抗吞噬；

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