MEV VP2截短片段可溶性表达及单克隆抗体制备

【摘要】水貂细小病毒(MEV)也称水貂细小肠炎病毒,主要引起水貂剧烈腹泻,有时伴有呕吐,是危害我国养貂业的主要疾病之一,对养貂业造成了巨大的经济损失。加拿大学者Schofield首次发现本病。目前该病还没有切实有效的治疗手段,预防以疫苗接种为主。因此,我们开展了水貂细小肠炎病毒主要抗原保护性蛋白VP2抗原表位富集区的克隆、原核表达与纯化,以及单克隆抗体制备,在此基础上,研制出可以用于水貂细小病毒感染初期快速诊断的ELISA试剂盒。VP2蛋白是MEV主要结构蛋白,也是病毒衣壳的主要组分,暴露在衣壳蛋白表面,是诱导机体产生中和抗体的主要靶蛋白。本实验通过蛋白质分析软件分析水貂细小病毒VP2基因上的主要抗原位点,针对编码的主要抗原位点设计了三对特异性引物,分别扩增Loop1、Loop2、Loop3基因,然后将克隆的基因插入到表达载体pET-32a中,转化到BL21(DE3)PLysS表达菌,IPTG诱导表达,超声处理后10000rpm离心,进行SDS-PAGE电泳,结果表明截短的三条VP2基因均获得了较好的可溶性表达,尤其是Loop3基因可溶性效果最好,表达的重组蛋白大小约为32KDa左右,其中目的蛋白10KDa,His标签蛋白22KDa。经过间接ELISA鉴定,本实验利用大肠杆菌原核表达系统所表达的重组蛋白具有与MEV阳性血清特异结合的良好反应原性。取本实验室保存的MEV-ZYL-1毒株,分离纯化接种FK81猫肾细胞扩大培养,收集病毒并将病毒26000rpm超速离心进行浓缩,将浓缩的病毒接种5周龄的雌性BALB/c小鼠,三免后用间接ELISA方法测小鼠血清效价,当效价达到1：1×105以上时,取骨髓瘤细胞与脾细胞进行细胞融合,以表达的三个可溶蛋白作为包被抗原,用已建立好的间接ELISA方法,进行阳性克隆株筛选,对连续三次筛选均为阳性的细胞孔采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行亚克隆,直到筛选出100%阳性细胞,最终筛选到5株稳定分泌抗MEV单克隆抗体的细胞。分别命名为1A6、1H9、2C3、2D4、3E8,其中1A6、1H9针对Loopl抗原表位区,2C3、2D4针对Loop2抗原表位区,3E8针对Loop3抗原表位区,经特异性实验鉴定筛选到的5株单抗均不与阿留申病毒发生交互反应,但与猫泛白细胞减少症病毒和犬细小病毒发生反应。因此五铢单克隆抗体可以作为诊断MEV、CPV、FPV的共同抗体,制备的单克隆抗体可用于MEV胶体金试纸条或ELISA检测试剂盒的研制。
【作者】张宁；
【导师】伍晓雄；沈志强；
【作者基本信息】华中农业大学，基础兽医学，2014，硕士
【关键词】VP2基因；MEV；可溶性表达；单克隆抗体；间接ELISA；

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