气单胞菌精氨酸脱亚胺酶基因的克隆、表达与定点突变研究

气单胞菌精氨酸脱亚胺酶基因的克隆、表达与定点突变研究

作者:师大云端图书馆 时间:2016-08-03 分类:硕士论文 喜欢:2986
师大云端图书馆

【摘要】L-瓜氨酸(L-citrulline)是人体尿素循环中的一种重要代谢产物,能够吸收并清除有害的自由基从而起到抗氧化的作用。瓜氨酸是由精氨酸脱亚胺酶(ArgininedeiminaseADIEC3.5.3.6)催化产生的。目前,生产L-瓜氨酸的方法主要有:发酵法,化学法,提取法和酶法。发酵法生产的缺点是L-瓜氨酸产率低。化学法生产的产品中含有L-瓜氨酸的旋光对映体D-瓜氨酸。提取法的生产工艺相对困难,产品很难纯化,因此成本比较高。酶法优点是生产条件温和,产品中无D型旋光对映体产生。酶法生产L-瓜氨酸是一种效率高,成本低的生产方法,将在瓜氨酸生产中起到重要作用。ADI将在未来瓜氨酸的生产中扮演重要的角色。本课题通过筛选得到一株产ADI的菌株,对该菌进行16SrRNA基因的序列分析,鉴定该菌属于Aeromonassp.。从中克隆精氨酸脱亚胺酶ADI的基因arc。该基因的全长有1221bp,起始密码子为ATG,终止子为TAA,GC含量为61.43%。ADI的基因arc编码406个氨基酸,ADI的分子量大小约为45.46kDa,等电点pI为6.17。通过SignalP4.1Server预测可知,该氨基酸的序列中没有信号肽。通过BLAST比对氨基酸序列分析发现,Aeromonassp的ADI与已报道的Pseudomonasplecoglossicida的ADI相似性最高,为46%。因此,本研究从Aeromonassp.中克隆到了较为新颖的ADI基因。将arc克隆到表达载体pGEX-6P-1上,构建重组质粒pGEX-6P-arc,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。通过IPTG的诱导,测定重组菌粗酶液的转化率,大小为30%。经纯化后得到纯酶ADI。对纯酶的酶学性质进行研究后发现,该酶的最适温度为55℃,最适pH为6.0,Km为0.66mmol/mL,最大反应速率Vmax为4.37μmol.mL-1.min-1,kcat为1.15s-1,kcat/Km为1.74mL/s-mmol。根据对相应的参考文献和精氨酸脱亚胺酶基因序列的综合分析,对精氨酸脱亚胺酶ADI的两个关键氨基酸残基M128,D404进行定点突变,获得ADI的突变株M128T,D404R。将突变株质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行重组表达与纯化,并对纯化获得的突变体蛋白进行酶学性质研究。结果表明,突变体M128T与野生型相比,最适pH由6.0升至6.5,接近生理pH。但是M128T,D404R的Km值,kcat值均有所下降,活性较野生型有所降低。根据实验结果分析推测,128和404位点可能位于ADI的催化中心或者附近,很可能是该催化中心的保守位点,间接说明了这两个位点在ADI的催化中起着十分重要的作用。具体机制还需要进一步结合晶体结构分析来解释。
【作者】冉诗;
【导师】刘子铎;
【作者基本信息】华中农业大学,微生物学,2014,硕士
【关键词】精氨酸脱亚胺酶;气单胞菌;筛选;酶学性质;定向进化;

【参考文献】
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