枯草杆菌蛋白酶的分离纯化、酶学性质及体外溶栓性质

【摘要】随着我国人口老龄化现象的日益严重，老年常发疾病血栓栓塞性疾病的发生也极为普遍，这种疾病也是当前致死率很高的病因之一，治疗这类疾病的主要手段则是溶栓疗法，而纤溶酶主要是催化血栓中的主要成分纤维蛋白水解，从而达到溶解血栓的目的，纤溶酶可来源于动物、植物、微生物，而微生物则是纤溶酶的主要来源，枯草芽孢杆菌是人类最早发现的细菌，由于它的生长环境多样，自身没有致病性，对高温、高热、电磁辐射、紫外线等具有很强抗逆性，它可利用的营养物质多种多样，且能直接将许多蛋白质分泌到培养基中，产生各种各样的酶，一直是生物界研究热点。本文采用单因素实验对实验室保存菌种枯草杆菌的发酵培养基组分及发酵条件进行优化，对发酵液产生的枯草杆菌蛋白酶进行分离纯化，测定了枯草杆菌蛋白酶中具有纤溶活性蛋白酶的部分酶学性质，并研究其体外溶栓特点，为后续工作的展开奠定了基础。1、为提高枯草杆菌蛋白酶的产量，采用单因素实验设计，通过摇瓶培养对枯草杆菌的发酵培养基及发酵条件进行优化，结果表明，优化后培养基（w/v）为：麦芽糖1%、蛋白胨2%、MgSO4·7H2O0.05%、CaCl20.02%、KH2PO40.4%；最适发酵条件为：初始pH7、温度37℃、接种量为1%，最佳培养时间为48h。2、将枯草杆菌按最优发酵培养基进行发酵培养48h后，将发酵液进行4℃、4000rpm离心20min，然后将发酵上清液加入60%饱和度的硫酸铵进行盐析、透析后冷冻干燥得到粗酶粉，然后利用CM-sepharoseFastFlow对枯草杆菌蛋白酶进行分离纯化，纯化后得到纯酶进行SDS-PAGE验证，最后得到的酶分子量显示低于14.3KDa，且具有纤溶酶活性，前人文献中未见报道，是一种新的溶栓酶。3、为明确枯草杆菌蛋白酶的酶学性质，研究了温度、pH、金属离子对其稳定性的影响。结果表明，枯草杆菌蛋白酶的最适反应温度为60-70℃、温度稳定性范围为40℃以下、最适反应pH为7，pH稳定性范围为6-8，未发现能增强该酶活性的金属离子。4、研究了枯草杆菌蛋白酶体外溶栓的特点，结果表明，枯草芽孢杆菌蛋白酶在体外具有良好的溶栓能力，且溶栓过程红细胞形态完整，对红细胞无损害，对酶浓度具有梯度依赖性，其分解纤维蛋白能力强，具有直接分解纤维蛋白的能力。本文分离纯化的枯草杆菌蛋白酶具有纤溶和体外溶栓能力，具有重要意义，其具体性质及体内溶栓的能力及特点将是下一步实验须进行的内容，为临床溶栓医药的研究奠定基础。
【作者】牛树壹；
【导师】韩宝芹；
【作者基本信息】中国海洋大学，海洋生物学，2014，硕士
【关键词】枯草杆菌蛋白酶；分离纯化；酶学性质；体外溶栓；

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