RA/RARα、BATF对IgA肾病患者扁桃体单个核细胞IgA类别转换的调控研究

【摘要】IgA肾病(immunoglobulinAnephrology,IgAN)是一组由多病因引起的具有相同免疫病理学特征的慢性肾小球疾病,以系膜区异常糖基化IgA沉积为主要病理表现。临床上主要表现为血尿、蛋白尿、高血压及肾功能损害。IgA肾病发病率居于原发性肾小球疾病的首位。约20%-40%的患者将进入慢性肾功能衰竭。然而IgAN发病机制尚未阐明。IgAN中肾脏沉积的IgA以多聚体IgAl亚型(pIgAl)为主。IgAl分子异常合成是IgA分子在翻译后水平发生异常糖基化的基础,也是由此种异常糖基化IgAl诱发肾脏损伤这一多米诺效应的起始阶段。黏膜免疫系统是体内IgA合成与分泌的重要场所,扁桃体作为黏膜免疫的重要组成部分,其免疫功能异常与IgAN发病密切相关。IgAN患者肾脏洗脱的IgA抗体可与该患者扁桃体细胞特异性结合,扁桃体切除术能有效降低IgAN患者循环池中IgA的水平及肾脏IgAl的沉积量。这说明肾脏沉积的IgAl至少部分来源于扁桃体。已有研究证实,在某些微生物抗原的刺激下,扁桃体单个核细胞能上调激活诱导的胞嘧啶脱氨酶(activationinducedcytidinedeanase,AID)这一免疫球蛋白类别转换(classswitchrecombination,CSR)关键酶的表达,增强CSR,导致B细胞合成的抗体在保持原有抗原特异性的同时发生类或亚类的转换。CSR这种生物学机制,改变了免疫球蛋白的重链恒定区,使B细胞由最初合成IgM或IgD,转为合成IgG,IgA或IgE。免疫球蛋白重链CH区局部基因片段转录形成的一个germline的转录本称Ig胚系转录(germlinetranscription,GT),IgA对应的GT为Iα-Cα。GT可与1g基因组形成不稳定的三聚体,从而保持基因局部的开放状态,使其得以转录和表达。CSR过程并未改变重链的可变区,这样既保证免疫球蛋白针对同一抗原又能使免疫球蛋白参与多种效应途径。经CSR合成的IgA中90%为IgA1。IgA1类别转换的发生使得局部及循环中IgA1水平增加,为低糖基化IgA1更多的在肾脏沉积提供了可能。多种细胞因子参与调节免疫球蛋白的类别转换。TGF-β,IL-5和IL-6参与调节IgA的类别转换。维甲酸(rentinoicacidRA)是维生素A代谢的中间产物,能为树突状细胞(dendriticcellsDC),肠道上皮细胞(epithelialcell,EC)等细胞所分泌,通过与核受体RAR,RXR结合来调节免疫,调控细胞增殖、分化、代谢及凋亡。RA效应的发挥受到靶细胞类型及细胞所处微环境的影响,这可能与RA受体分布具有一定的组织差异性及RA发挥时所处细胞因子网络不同相关。在肠道派氏结中(Peyer’spatches,PP),RA能促进淋巴细胞增殖并表达归巢受体,促进B细胞向IgA+浆细胞转化。但RA/RAR通路在扁桃体中的表达情况,及其与IgAN发病的关系未见报导。碱性亮氨酸拉链转录因子BATF(basicleucinezippertranscriptionfactor)属于AP(activatorprotein)超家族。BATF广泛表达于免疫组织,介导Th17、Th2、Tfh的细胞分化,调节B细胞免疫球蛋白类别转换。在肠道粘膜免疫系统中,BATF作为必要条件,参与RA诱导的CD4+T细胞归巢信号的表达。但在扁桃体中BATF表达如何；是否能推进扁桃体单个核细胞免疫球蛋白类别转换向IgA生成的方向发展；以及作为转录因子,是否与RA/RAR通路存有交互作用值得探讨。临床上,IgA肾病患者常表现出与粘膜组织感染相一致的病情反复与进展。尤以上呼吸道感染后肉眼血尿加重最为常见。IgA肾病的发生与黏膜组织对外来抗原免疫应答紊乱密切相关。我们前期的研究证实,革兰氏阳性菌中的甲型溶血性链球菌是慢性扁桃体炎及IgAN患者扁桃体中的主要菌种,脂多糖则是革兰氏阴性菌细胞壁的共同主要抗原成分。本课题采用灭活的甲型溶血性链球菌和脂多糖作为干预手段,体外模拟上呼吸道感染对扁桃体的刺激作用,观察扁桃体单个核细胞RA/RAR、BATF表达的变化,分析其与IgA类别转换的关系,为IgA肾病防治提供新的理论依据和治疗靶点。第一章RA/RARa在腭扁桃体中的表达及与IgAl、IgA肾病临床指标相关性的研究目的：检测腭扁桃体RA/RARa表达,分析RA/RARa与IgA1水平及IgA肾病患者eGFR、蛋白尿、血尿的关系。方法：收集经临床和肾活检确诊为IgA肾病患者的腭扁桃体20例做为观察组(IgAN组),慢性扁桃体炎非肾炎患者22例作为对照组(CT组)。免疫组织化学检测腭扁桃体组织RARa的表达水平；密度梯度离心法分离腭扁桃体单个核细胞,采用RT-PCR和Westernblot技术分别检测RARamRNA和蛋白表达水平；ELISA检测细胞培养液上清中RA、IgA1含量；分析RA、RARα与IgAN组eGFR、蛋白尿、血尿的关系。结果：1.免疫组化结果显示；扁桃体RARα表达主要集中在淋巴小结生发中心和扁桃体上皮层。与对照组比较,IgAN组RARα在上述部位表达明显增加。2.RT-PCR及Westernblot结果均提示IgAN组RARamRNA和蛋白表达较CT组升高。3.IgAN组腭扁桃体单个核细胞培养上清IgAl水平,RA水平较CT组明显升高。4.相关性分析提示IgAN腭扁桃体单个核细胞RA、RARa表达水平与eGFR呈负相关,与IgA1、蛋白尿、血尿水平呈正相关。结论：RA/RARα信号通路在IgAN患者腭扁桃体中处于激活状态；免疫组化、RT-PCR及Westernblot结果均证实了IgAN患者腭扁桃体RARa的高表达。且RA/RARα与IgA1及IgAN主要临床指标密切相关。提示RA/RARα可能通过促进IgA1的产生参与IgAN的致病,并在IgAN发展进程中发挥作用。第二章RARα、BATF与IgA1类别转换相关基因AID、Ia-Ca相关性的研究目的：观察BATF在腭扁桃体中的表达情况及与IgA1表达水平的相关性,分析RARα、BATF与IgA1类别转换基因AID、Ia-Ca胚系转录本的相关性。方法：收集IgA肾病组及对照组腭扁桃体。免疫组织化学检测腭扁桃体组织BATF的表达水平；密度梯度离心法分离腭扁桃体单个核细胞,采用RT-PCR技术分别检钡BATF、AID、Ia-CamRNA水平；Westernblot检测BATF、AID蛋白表达水平,ELISA检测细胞培养液上清IgA1含量。以第一章节所测RARamRNA及蛋白表达值,与AID、Ia-Ca行相关性分析,并分析BATF与AID、Ia-Ca、IgA1的相关性。结果：1.免疫组化结果显示：BATF表达主要集中在扁桃体淋巴小结生发中心和扁桃体上皮层；与对照组比较,IgAN组BATF在上述部位表达明显增加。2.RT-PCR结果提示IgAN组BATF、AID、Ia-CamRNA表达较CT组升高。Westernblot显示IgAN组BATF、AID蛋白表达水平较CT组升高。3.采用Pearson相关分析及直线回归,发现IgAN腭扁桃体单个核细胞BATF表达水平与AID、Ia-Ca、IgAl呈正相关。RARa表达水平与AID、Ia-Ca呈正相关。结论：(1)RARα在IgAN患者腭扁桃体中表达上调与IgAl类别转换相关基因表达增高密切相关,说明RA/RARα可能通过促进IgAl类别转换增加IgAl的合成。(2)BATF在IgAN患者腭扁桃体表达上调,且与RARa及IgAl类别转换相关基因表达增高一致,提示BATF可能参与调节RA/RARα促进扁桃体单个核细胞IgAl类别转换的过程。第三章脂多糖、甲型溶血性链球菌对腭扁桃体单个核细胞RA、RARα、BATF、AID、Ia-Ca.IgAl的影响目的：采用脂多糖(lipopolysaccharideLPS)、甲型溶血性链球菌(a-HemolyticstreptococcusHS)刺激腭扁桃体单个核细胞,探讨RA/RARa通路及BATF在LPS、HS促进扁桃体单个核细胞AID、Iα-Cα表达及IgAl分泌中的作用。方法：腭扁桃体单个核细胞培养体系中,分别加入LPS(终浓度为10ug/ml)、灭活的HS(浓度为1×108cfu/ml)刺激72小时,RT-PCR技术分别测定RARα、BATF、AID、Ia-CamRNA量；Westernblot技术分别测定RARα、BATF、AID蛋白表达,ELISA技术测定培养液上清中IgA1及RA水平的变化。结果：1.IgAN腭扁桃体单个核细胞接受LPS、HS刺激后,RARa.BATF、AID、Ia-CamRNA和RARα、BATF、AID蛋白表达均上调,IgAl、RA分泌增加,HS较LPS上调作用更为明显。2.CT组在LPS、HS刺激下,RARα、BATF、AID、Ia-CamRNA和RARα、BATF、AID蛋白表达均上调,IgA1分泌增加。但增高程度低于IgAN组。结论：LPS、HS通过激活IgA肾病腭扁桃体RA/RARa信号通路,上调BATF表达,促进IgAl的类别转换,导致IgA1分泌增多。第四章RARα-siRNA或BATF-siRNA对甲型溶血性链球菌及脂多糖诱导的腭扁桃体单个核细胞IgA类别转化的影响目的：拟分别采用RARα-siRNA及BATF-siRNA沉默RARα及BATF基因表达,观察其对LPS、HS刺激下腭扁桃体单个核细胞IgA1类别转化的影响。观察BATF-siRNA对RA刺激下腭扁桃体单个核细胞IgA1类别转化的影响,初步探讨RA/RARα与BATF在促进扁桃体单个核细胞IgAl类别转化中的关系。方法：分离腭扁桃体单个核细胞,转染RARα-siRNA及BATF-siRNA,用RT-PCR、Westernblot方法分别检测转染前后,AID、Ia-CamRNA和AID蛋白表达；ELISA测定培养液上清中IgA1水平的变化。结果：1.转染RARα-siRNA后,无论有无LPS、HS刺激,IgAN患者扁桃体单个核细胞AID、Ia-CamRNA水平均明显下降,AID蛋白水平及IgA1较未转染组降低。2.转染BATF-siRNA后,无论有无LPS、HS刺激,IgAN患者扁桃体单个核细胞AID、Ia-CamRNA水平均明显下降；AID蛋白水平降低；转染后IgA1水平明显降低。3.予以RA刺激并转染BATF-siRNA,IgAN患者扁桃体单个核细胞AID、Ia-CamRNA水平较转染空质粒组明显下降,IgA1水平明显降低。结论：RARα-siRNA或BATF-siRNA转染能降低IgA肾病患者腭扁桃体单个核细胞AID,Iα-Cα表达和IgA1分泌。在LPS及HS刺激下,RARα-siRNA和BATF-siRNA转染同样能减低AID,Iα-Cα表达。且BATF-siRNA抑制作用更明显。BATFsiRNA能抑制RA/RARα诱导下的IgA类别转换及IgA1分泌。推测BATF可能位于RA/RARα促进扁桃体单个核细胞IgA类别转换通路的下游,为RA/RARα通路介导IgACSR所必需。RA/RARα/BATF通路可能参与了IgA肾病患者扁桃体单个核细胞的异常IgA类别转换；沉默RARα基因或BATF基因能减少IgA肾病患者扁桃体IgA1的产生。
【作者】陈愔音；
【导师】彭佑铭；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】IgA肾病；腭扁桃体；RA/RARα；IgA1；BATF；AID；Ia-Ca；类别转换；LPS；HS；RARα；siRNA；类别转化；

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