丝裂霉素C和几丁糖对膝关节术后瘢痕粘连的作用及机理的研究

【摘要】膝关节瘢痕粘连是膝关节术后常见的并发症之一,常会导致膝关节屈伸受限、关节僵硬,严重影响手术效果。近年来发现,丝裂霉素C和几丁糖在防治术后瘢痕粘连方面有着较好的临床和实验效果。但是,关于丝裂霉素C和几丁糖预防膝关节术后瘢痕粘连的作用和机制研究甚少。本研究通过体外培养人成纤维细胞和建立兔膝关节术后瘢痕粘连模型,综合评估丝裂霉素C和几丁糖对兔膝关节术后粘连的预防作用,并探讨这两种药物的对成纤维细胞增殖、凋亡的影响。本研究可明确丝裂霉素C和几丁糖预防膝关节内瘢痕粘连的机理,为临床预防膝关节术后瘢痕粘连提供理论依据和新的治疗靶点,并寻找一种简单、有效的预防膝关节术后瘢痕粘连的新方法。第一章丝裂霉素C和几丁糖抑制成纤维细胞增殖的实验研究目的观察丝裂霉素C和几丁糖对人成纤维细胞增殖的抑制作用。方法体外培养人成纤维细胞,应用不同浓度的丝裂霉素C和几丁糖处理成纤维细胞,于处理后第1、2、3、5天收集细胞,倒置显微镜下观察成纤维细胞的形态学变化,并利用MTT法检测丝裂霉素C和几丁糖对成纤维细胞的抑制作用。结果1.成纤维细胞在不同浓度的丝裂霉素C和几丁糖作用下,细胞的生长形态出现不同的变化。随着药物浓度不断的增加,细胞生长受到明显的抑制,抑制率逐渐增高,细胞数目明显减少。2.应用特定浓度丝裂霉素C和几丁糖作用成纤维细胞后,随着时间的逐渐延长,丝裂霉素C和几丁糖对成纤维细胞的抑制作用逐渐增强,抑制率逐渐增加。结论1.不同浓度的丝裂霉素C和几丁糖作用于体外培养的人成纤维细胞后,可以发现成纤维细胞的形态、生长特性发生了明显改变；结合MTT法检测,提示丝裂霉素C和几丁糖能抑制成纤维细胞的增殖。2.随着药物浓度的增加,丝裂霉素C和几丁糖对细胞增殖的抑制作用逐渐增强。3、随着用药时间的延长,丝裂霉素C和几丁糖对细胞增殖的抑制作用也逐渐增强。第二章丝裂霉素C和几丁糖诱导成纤维细胞凋亡的机制研究目的探讨丝裂霉素C和几丁糖诱导人成纤维细胞凋亡的分子机制。方法体外培养人成纤维细胞,应用不同浓度的丝裂霉素C和几丁糖处理成纤维细胞,采用Hoechst33342染色观察成纤维细胞凋亡的情况,AnnexinV-PI双染色法检测细胞的凋亡率,采用western-blot检测凋亡相关蛋白活化Caspase-3、Bax、CHOP、Bcl-2等表达水平。结果1.Hoechst33342染色结果显示不同浓度的丝裂霉素C处理成纤维细胞后,呈凋亡的细胞核均多于对照组,而0.8mg/ml丝裂霉素C组中凋亡的细胞核最多；不同浓度的几丁糖处理成纤维细胞后,凋亡细胞核均多于对照组,其中10mg/ml几丁糖组的凋亡细胞核最多。2.AnnexinV/PI双染色流式细胞仪检测结果显示不同浓度丝裂霉素C组的细胞凋亡率明显高于对照组,而0.8mg/ml丝裂霉素C组的细胞凋亡率明显高于其他浓度组；不同浓度几丁糖组的细胞凋亡率明显高于对照组,其中10mg/ml几丁糖组的细胞凋亡率高于其他浓度组。3.随着丝裂霉素C浓度增加,Westernblot检测活化Caspase-3、Bax、CHOP的蛋白表达随之增加,而Bcl-2的蛋白表达则逐渐下降。随着几丁糖浓度的增加,活化Caspase-3、Bax、CHOP的蛋白表达也逐渐增加,而Bcl-2的蛋白表达呈现下降趋势。结论1.不同浓度的丝裂霉素C和几丁糖作用于体外培养的人成纤维细胞,Hoechst33342染色和AnnexinV/PI双染色流式细胞仪检测分析提示丝裂霉素C和几丁糖能诱导人成纤维细胞凋亡。2.随着丝裂霉素C和几丁糖浓度的增加,成纤维细胞的凋亡率不断增加,并呈现浓度-效应依赖关系。3.结合Westernblot结果,丝裂霉素C和几丁糖能通过线粒体途径、死亡受体损伤和内质网应激等多种途径诱导人成纤维细胞的凋亡。第二章丝裂霉素C和几丁预防兔膝关节术后瘢痕粘连的实验研究目的观察并比较丝裂霉素C和几丁糖预防兔膝关节术后瘢痕粘连的效果。方法选取48只新西兰大白兔建立膝关节术后瘢痕粘连动物模型,随机分成三组：丝裂霉素C组、几丁糖组和生理盐水对照组,每组16只。术后4周行大体解剖观察、羟脯氨酸含量测定、组织学观察和成纤维细胞计数等检测。结果所有动物术后均恢复良好,无切口感染、皮肤坏死、死亡等情况。结果显示：1.大体观察发现丝裂霉素C组有轻度的膜性瘢痕粘连,几丁糖组有中度纤维样瘢痕粘连,而对照组有致密的瘢痕组织。2.丝裂霉素C组和几丁糖组瘢痕羟脯氨酸含量明显低于对照组(P<0.05)；而丝裂霉素C组低于几丁糖组(P<0.05)。3.组织学观察发现丝裂霉素C组有薄膜样的瘢痕组织,少量的成纤维细胞散在瘢痕组织中；几丁糖组有疏松样的瘢痕组织,瘢痕组织中可见中等量的成纤维细胞；对照组有致密的瘢痕组织,与股骨髁连接紧密,瘢痕中见大量的成纤维细胞。4.丝裂霉素C组和几丁糖组成纤维细胞计数明显低于对照组(P<0.05),而丝裂霉素C组低于几丁糖组(P<0.05)。结论1.本实验中成功建立了兔膝关节术后瘢痕粘连动物模型。2.术中局部应用丝裂霉素C和几丁糖都能够抑制膝关节术后成纤维细胞的增殖、减少胶原组织形成,可有效预防兔膝关节术后瘢痕粘连；而丝裂霉素C的效果要优于几丁糖组。3.本实验中各组动物无皮肤坏死、死亡等并发症,病理学观察也未发现明显的不良反应,可能与局部应用的丝裂霉素C和几丁糖浓度低、与组织接触时间短、吸收量少等有关。
【作者】王静成；
【导师】尹邦良；吕国华；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】丝裂霉素C；几丁糖；人成纤维细胞；增殖；MTT法；细胞凋亡；活化Caspase-3；Bax；CHOP；Bcl-2；Hoechst33342染色；AnnexinV-PI双染色；膝关节；关节内粘连；成纤维细胞；兔；羟脯氨酸含量；HE染色；

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