活性氧、激素互作、自噬和转录因子在番茄和拟南芥逆境胁迫响应中的作用机理和调控

【摘要】我国地域辽阔,各地蔬菜生产经常受到低温、高温、盐害、干旱以及多种病害的影响。尤其是近年来在温室效应和人类活动的共同作用下,极端气候现象发生更为频繁,我国各地冬春季节的冷害、夏秋季节的热害以及北方和西南地区的旱灾也日趋严重,这极大地制约了我国蔬菜的生产和供应。因此,剖析植物对逆境胁迫的响应机制,运用分子遗传学、生理生化学和环境调控等手段增强蔬菜作物对不良环境条件的抗性,对提高蔬菜产量、品质和经济效益,以及建立可持续农业皆具有十分重要的科学和现实意义。本文先以番茄(SolanumlycopersicumMill.)为材料,研究了H2O2信号在低温驯化调控番茄抗冷性中的作用；并利用病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)进一步探讨了活性氧(ROS)在交叉驯化调控非生物胁迫中的关键作用；通过运用遗传学、生理学、分子生物学等手段研究了BR和ABA诱导的H202在调控番茄抗性中的动态关系。又以模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)为材料,研究了NBR1介导的选择性植物自噬体在逆境胁迫中响应机制；并通过遗传学手段功能分析了E3泛素连接酶CHIP在植物逆境胁迫中的作用。最后,通过比较拟南芥、番茄等植物WRKY33同源基因的进化和功能,研究了WRKY33转录因子在拟南芥和番茄胁迫响应中的调控机理。所得主要结果如下：1.研究H202信号在低温驯化调控番茄抗冷性中的作用。低温驯化(12/10℃)可以温和提高番茄叶片H202水平,RBOH1基因表达和NADPH氧化酶活性,并诱导了抗氧化酶基因表达和酶活性。在未经过低温驯化的植株中,冷胁迫(7/4℃)造成H2O2含量、膜质过氧化水平(MDA)和氧化态谷胱甘肽含量的持续提高,同时,CO2同化速率(Asat)和光系统II最大光化学效率(Fv/Fm)显著下降。而在低温驯化植株中,冷胁迫产生的光抑制、膜质过氧化和CO2同化速率下降等症状得到了显著的缓解。此外,在植株进行低温驯化前预处理NADPH氧化酶的抑制剂(DPI)和H202的清除剂(DMTU)破坏了低温驯化在光合作用和抗氧化代谢中的积极作用,导致低温驯化诱导的冷害抗性消失。这些结果充分表明,NADPH氧化酶在植物细胞细胞膜上产生的H202在低温驯化诱导的冷害抗性中具有重要的作用。2.研究RBOH1产生的H2O2及随后激活的MPK1/2在驯化诱导番茄交互抗性中的关键作用。低温驯化、百草枯驯化和干旱驯化均可以增强番茄对冷害、无氧化胁迫和极端干旱的抗性。驯化诱导诱导了RBOH1基因和胁迫和防御相关基因转录水平的上调,并提高了植物质外体中H2O2的积累,增强了NADPH氧化酶和抗氧化酶活性,提高了还原态谷胱甘肽含量和MPK1/2的活性。病毒诱导的RBOH1、MPK1、MPK2和MPK1/2基因沉默均破坏了驯化诱导的交叉抗性和对胁迫产生的抗性。总之,这些结果强烈显示驯化诱导的交叉抗性主要依赖于在细胞膜上由RBOHl产生的H2O2,以及随后由H2O2激活的MPK1/2来诱导胁迫响应。3.研究BR和ABA诱导的H2O2在调控番茄抗性中的动态关系。结果表明,番茄BR和ABA合成缺失突变体和NADPH氧化酶RBOH1基因的沉默植株对高温和光氧化胁迫均表现出敏感性。其中,在ABA合成缺失突变体中,外源处理BR只能短暂诱导其RBOH1基因表达,H2O2积累和抗逆性,而ABA能够有效且持续提高BR合成缺失突变体的这些效果。BR合成缺失突变体内源ABA含量低于野生型植株,但通过外源处理BR后提高了其内源ABA水平。RBOH1基因沉默抑制了BR诱导的H2O2产生、ABA积累和胁迫响应。然而,ABA诱导的胁迫响应在RBOH1沉默植株中仍然是正常的。研究表明,BR诱导的抗逆性涉及一个正反馈机制,其中,BR诱导由NADPH氧化酶快速而短暂地产生H2O2来首先触发ABA合成,再由ABA进一步诱导H2O2产生,从而持续提高抗逆性。研究也表明,ABA诱导的H2O2产生同时来源于质外体和叶绿体。4.研究自噬体的介导蛋白NBR1在选择性植物自噬体逆境胁迫中响应的作用机制。结果表明,两个独立的nbr1缺失突变体均表现出部分而非全部自噬体缺失突变体atg5和atg7的表现型。与ATG5和ATG7相似,NBR1在植物对高温、氧化胁迫、盐和干旱胁迫中都具有重要作用。并且,NBR1在植物应对这些非生物胁迫抗性中的作用依赖于与ATG8蛋白的互作。然而与ATG5和ATG7不同,NBR1在年龄和黑暗导致的衰老和对腐殖营养型病原体的抗性中并非必要。NBR1在植物对一些特殊的非生物胁迫的选择性响应显示植物的自噬体在不同生物学过程中运行着不同的介导和识别系统。atg5、atg7和nbr1突变体的热敏感性伴随着不可溶蛋白积累的增加,并且这些蛋白在热胁迫下是高度泛素化的。NBR1蛋白包含了一个泛素结合域,在热胁迫下,其不可溶性蛋白在自噬突变体中的聚集也大量提高。这些结果显示,NBR1介导的自噬体可能将胁迫条件下产生的变性或其它损坏的外来蛋白泛素化,并形成蛋白聚集体吞噬。5.研究E3泛素连接酶CHIP和NBRl介导的选择性自噬体在植物胁迫响应中对蛋白毒性的叠加保护。结果表明,两个独立的chip缺失突变体在高温、氧化胁迫和盐胁迫中均表现与nbrl相同的敏感性,并在高温胁迫下增加了不可溶蛋白的聚集。为了确定CHIP和NBRl之间的功能异同,我们产生了chipnbrl双突变体并发现其进一步增加了对胁迫的敏感性,减弱了对胁迫诱导的蛋白聚集体的清除,这显示CHIP和NBR1的作用具有叠加性。此外,在chip突变体中胁迫诱导的蛋白聚集体仍然是被泛素化的。基于这些结果,提出CHIP和NBR1调节两个独立但互补抗蛋白毒性途径,其中CHIP对错误折叠蛋白进行泛素化修饰并通过26S蛋白酶体进行降解,同时另一个未知的E3泛素化连接酶对胁迫诱导产生的蛋白聚集体进行泛素化修饰并通过NBR1介导的选择性自噬体进行降解。通过对chip和nbrl单突变体和双突变体热胁迫产生蛋白聚集体的蛋白组学分析,我们发现短期热胁迫后,在nbrl突变体中Rubisco活化酶、过氧化氢酶等蛋白优先发生聚集；而在chip突变体中,光捕蛋白复合蛋白积累较高。随着热胁迫时间的延长,细胞内大量的蛋白在chip和nbrl单突变体积累都增加,并且chip和nbrl双突变体沉淀蛋白种类和数量更多。综上可以看出,CHIP和NBR1介导了两个独立但互补的抗击蛋白毒性的途径,并且胁迫下蛋白聚集倾向性是蛋白途径选择的重要决定因素。6.研究WRKY33同源基因在植物胁迫响应中的进化和功能。结果表明,与同源基因AtWRKY25相比,AtWRKY33有一个延长的C末端结构域(CTD)。CaMV35S强启动子驱动的AtWRKY25和AtWRKY33ACTD(CTD缺失突变体)均能恢复wrky33突变体植株对腐殖营养型真菌灰霉菌和热胁迫的敏感性。相反的,由AtWRKY33基因启动子驱动的AtWRKY25和AtWRKY33ACTD,或AtWRKY25基因启动子驱动的AtWRKY33不能恢复wrky33突变体植株对灰霉菌和热胁迫的敏感性。因此,特殊CTD的蛋白结构和基因启动子驱动模式对AtWRKY33在植物逆境响应中的生物学功能起着关键的作用。基因聚类分析在单子叶和双子叶植物中得到了AtWRKY33的同源序列,其中番茄中有两个同源序列(S1WRKY33A和S1WRKY33B).与AtWRKY33相同,SIWRKY33A和SIWRKY33B基因能被灰霉菌和热胁迫强烈诱导。病毒诱导的SlWRKY33A和SlWRKY33B基因沉默使得番茄植株对灰霉菌和热胁迫表现出敏感性。由AtWRKY33启动子驱动的SlWRKY33A和SIWRKY33B能完全恢复拟南芥atwrky33对灰霉菌和热胁迫的敏感性。这些结果表明,WRKY33蛋白作为进化保守的转录因子在植物响应生物非生物逆境中起着关键的作用。
【作者】周杰；
【导师】喻景权；陈志祥；
【作者基本信息】浙江大学，蔬菜学，2014，博士
【关键词】CHIP；E3泛素化连接酶；MAPK；NADPH氧化酶；NBR1；RBOH1；VIGS；WRKY33；不可溶泛素化蛋白；蛋白毒性；番茄；防御反应；功能分析；过氧化氢；交互抗性；抗氧化物；耐冷性；拟南芥；热胁迫；脱落酸；油菜素内酯；活性氧；信号传导；选择性自噬体；

【参考文献】
[1]杜丽丽.我国大众媒体社区报道的特点[D].西北大学,新闻学,2014,硕士.
[2]张宇廷.中国汉族人群rs556621变异与缺血性脑卒中关联分析研究[D].华中科技大学,遗传学,2013,硕士.
[3]张波,刘胜辉.基于遗传BP神经网络的数据挖掘技术[J].自动化技术与应用,2005,09:4-6.
[4]迟振杰.企业知识创新与组织要素特征研究[D].山东大学,企业管理,2013,硕士.
[5]杜佳音.平面网格函数空间上的线性混沌映射[D].华东师范大学,应用数学,2004,硕士.
[6]范乐乐.微波加热除湿技术的研究及在蒸发冷却空调中的应用[D].哈尔滨工业大学,建筑与土木工程,2014,硕士.
[7]韩敏.我国上市公司内部控制审计的信息含量分析[D].北京林业大学,会计学,2013,硕士.
[8]魏明军,崔素君.矿热炉除尘器微机控制系统[J].冶金自动化,1996,06:42-44.
[9]袁俊.面向汽车零部件的虚拟装配技术研究[D].吉林大学,机械制造及其自动化,2013,硕士.
[10]邓志超.高效视频编码帧间预测中运动估计算法研究[D].重庆大学,仪器科学与技术,2014,硕士.
[11]王春艳.陕西省农村剩余劳动力转移模式研究[D].西安建筑科技大学,科学技术哲学,2004,硕士.
[12]江林强.CRM与期货客户关系管理[N].期货日报,2003-02-18.
[13]冯艳红.基于Android平台社区服务系统研究与实现[D].宁波大学,电子与通信工程（专业学位）,2014,硕士.
[14]王恬,张琳,阎维贤.交-直流势驱动下的应力石墨烯势垒中Dirac粒子的隧穿[J].华中师范大学学报(自然科学版),2014,06:821-828.
[15]王晓,韩崇昭.基于混合采样的多模型机动目标跟踪算法[J].自动化学报,2013,07:1152-1156.
[16]王楠,张粒子,刘宝成,唐庆华,崔宁宁.日前节能发电调度计划与实时控制的协调方式[J].电力系统自动化,2012,17:45-49+55.
[17]龚玉雷,魏春,王芝彪,沈雪亮.生物酶在茶叶提取加工技术中的应用研究[J].茶叶科学,2013,04:311-321.
[18]高立东.特殊形貌纳米二氧化钛和钛酸钙的制备表征与性能研究[D].北京化工大学,化学工艺,2006,博士.
[19]李泽鑫.城市设计视角下的我国城市商业综合体临街界面空间设计研究[D].西南交通大学,建筑设计及其理论,2013,硕士.
[20]严逗.Textlinguistische Analyse der deutschen Stellenanzeige im Internet[D].西安外国语大学,德语语言文学,2014,硕士.
[21]刘岳.城乡结合部学校初中生的特点及教育管理研究[D].吉林大学,教育管理,2014,硕士.
[22]刘豪.属于穷人的社会企业[D].华中师范大学,社会学,2013,硕士.
[23]李仕雷.肝细胞癌伴门静脉癌栓的临床诊断及治疗[D].大连医科大学,外科学,2012,硕士.
[24]杨慧琼.DFMG对HUVE-12细胞CD40/CD40L的表达及单核细胞/内皮细胞黏附的影响[D].湖南师范大学,内科学,2013,硕士.
[25]贠苗苗.完善我国植物新品种保护制度的研究[D].吉林财经大学,法律,2014,硕士.
[26]吴琴.双模竞争J-C模型与非线性J-C模型的动力学性质研究[D].湖南师范大学,理论物理,2004,硕士.
[27]石立旺.内爆炸作用下抗爆间室动力响应及防护措施研究[D].哈尔滨工业大学,建筑与土木工程,2013,硕士.
[28]展之宽.基于KDJ和MACD指标的触发式基金定投设计和可行性验证[D].兰州大学,金融（专业学位）,2013,硕士.
[29]张志飞.传声器阵列近场鲁棒性算法研究[D].南京大学,声学（专业学位）,2013,硕士.
[30]程英.“审美与快乐”式幼儿音乐教育初探[D].福建师范大学,教育,2003,硕士.
[31]黄英.PRMT6介导的p16蛋白精氨酸甲基化的抑制促进p16诱导的A549细胞周期的停滞[D].东北师范大学,细胞生物学,2012,硕士.
[32]李葳.面向服务架构的应用集成平台的研究与开发[D].华中科技大学,2004.
[33]刘嘉.《史记》“太史公曰”文体研究[D].华东师范大学,中国古代文学,2013,硕士.
[34]邓桂芳.耐缺氧功能性食品的初步研究[D].天津科技大学,发酵工程,2004,硕士.
[35]卜文锐.基于灰色关联分析的低产油井生产方案研究[D].西安科技大学,模式识别与智能系统,2013,硕士.
[36]苏珊.城市滨水型绿道规划设计研究[D].华中科技大学,风景园林,2013,硕士.
[37]马帅.基于浮动圆锥法的三道庄露天矿境界优化[D].西安建筑科技大学,采矿工程,2013,硕士.
[38]马保科.电离层对电波传播影响的相关问题研究[D].西安电子科技大学,无线电物理,2013,博士.
[39]黄美虹.乙型肝炎病毒母婴传播及阻断的相关因素探讨[D].福建医科大学,妇产科学,2014,硕士.
[40]施添翼.精密玻璃透镜热压成型炉结构及温度曲线设计[D].中国科学技术大学,机械电子工程,2014,硕士.
[41]何蓓,吴敏.一种基于Bayesian信念网络的客户行为预测方法[J].控制与决策,2007,06:626-631.
[42]刘艮.基于脆弱水印的数字图像认证算法设计与实现[D].中南民族大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[43]余晨韵.基于压缩编码的JPEG2000数字图像加密算法研究[D].重庆大学,计算机软件与理论,2014,硕士.
[44]杨云.安徽省农业产业化龙头企业技术创新能力评价与提升对策研究[D].安徽农业大学,农业经济管理,2012,硕士.
[45]燕飞,唐涛.轨道交通信号系统安全技术的发展和研究现状[J].中国安全科学学报,2005,06:94-99+113.
[46]张松艳.基于遗传算法的FlowShop调度的研究与应用[D].浙江工业大学,2009.
[47]李慧.家族企业治理模式及其优化[D].西北工业大学,西方经济学,2004,硕士.
[48]孙雯玉.人脸表情识别算法研究[D].北京交通大学,2006.
[49]何鹤雄.结构转变下的人口红利对经济发展的影响[D].厦门大学,国民经济学,2014,硕士.
[50]梁茂华.越南文字发展史研究[D].郑州大学,世界史,2014,博士.