线虫脂肪酸代谢与性别决定研究

【摘要】身体摄入能量过多而能量支出减少引起肥胖的出现,肥胖能触发Ⅱ型糖尿病、心血管疾病等疾病的发生,给人类健康带来重大隐患。引起人类肥胖的众多因素中,基因起主导作用,因此研究肥胖的遗传和生化机制已经迫在眉睫。脂肪酸代谢通路中存在着一系列称作脂酰辅酶A合成酶的基因ACSs(Acyl-CoASynthetase),它们催化自由脂肪酸与辅酶A形成脂酰辅酶A。所有自由脂肪酸都必须在ACSs作用下激活成脂酰辅酶A后方能进入代谢途径。此外ACSs的产物脂酰辅酶A在胞内还可直接与膜相互作用、为脂酰修饰蛋白提供底物、作为能量调节因子及参与膜泡运输等。因此研究ACSs的功能对于理解肥胖的机制及信号通路的调控都有很大的帮助。本文利用线虫为模式生物研究脂酰辅酶A合成酶基因acs-4的功能,重点分析了acs-4突变体绝育的表型、acs-4的功能及acs-4失活引起绝育的机制。acs-4突变体有两个独立性状：acs-4的失活导致雌雄同体的性腺被雄性化不能产生卵细胞,所有应该分化成为卵细胞的性腺细胞都分化成为精母细胞,这是性别决定问题；此外acs-4失活还阻断两性个体中精母细胞向精子的分裂过程,从发育过程上来说这个性状出现于性别决定之后。本文主要研究了acs-4雌雄同体突变体的性腺雄性化表型。研究发现acs-4的表达位置非常广泛,包括肠细胞、神经细胞及性腺体细胞,但性腺雄性化的表型主要与acs-4在性腺中的失活有关。遗传分析发现acs-4突变体的表型是性别决定信号通路的改变导致的。基因fog-1和fog-3的失活突变能抑制acs-4突变体的性腺雄性化表型使之产生卵细胞。另femm-1,-2，-3的失活突变也能拯救acs-4突变体不能产生卵细胞的缺陷。此外tra-2(gf)突变体及能提高tra-2表达水平的突变体fog-2(lf)和ufd-2(RNAi)也能抑制acs-4突变体的性腺雄性化表型。因此遗传上acs-4位于tra-2的上游。ACS-4作为脂酰辅酶A合成酶,很可能通过影响脂类的代谢改变性腺的性别决定通路。但质谱和气相色谱分析发现acs-4突变体的脂类丰度和脂肪酸成分,与对照相比并没有明显的差别。为了找到作用于acs-4下游的基因,本研究对转移酶基因进行RNAi筛选。筛选发现性腺中失活N-14碳脂酰基转移酶基因nmt-1的功能引起雌雄同体的性腺被雄性化,这暗示ACS-4可能为NMT-1提供底物进行蛋白质的C14脂酰修饰。C14脂酰蛋白修饰另一必需基因map-2的失活也会导致雌雄同体的性腺被雄性化,这进一步证明了C14脂酰蛋白修饰与性别决定相关。实验还发现acs-4和acs-17存在功能上的冗余,通过酵母基因互补实验还发现ACS-4和ACS-17能激活C14和C16脂肪酸。这进一步证明生化上ACS-4为NMT-1提供底物是可行的,而且这也证明了acs-4和acs-17在生化功能上的冗余。以上结果暗示：在野生型线虫N2中ACS-4为NMT-1提供底物进行C14脂酰蛋白修饰,而在acs-4突变体中能被NMT-1利用的C14-CoA的水平过低导致某些蛋白质的C14脂酰修饰不能进行既而影响了性腺中的性别决定信号通路。本文尝试通过增加胞内的C14-CoA的水平来拯救acs-4突变体的性腺雄性化表型。首先,外源注射C14-CoA到acs-4突变体的性腺能拯救acs-4突变体不能产生卵细胞的缺陷；其次,食物中添加外源脂肪酸也能在acs-4突变体中恢复卵细胞的产生,而且喂食外源脂肪酸恢复卵细胞依赖于acs-17的表达；再次,通过prx-5(lf)和prx-6(lf)突变体失活过氧化物酶体提高胞内C14-CoA的水平也能使acs-4突变体恢复卵细胞；最后,RNAi失活C14-CoA延伸所需基因elo-1和elo-2也能部分拯救acs-4突变体不能产生卵细胞的缺陷。以上实验证明提高胞内的C14-CoA水平能拯救acs-4突变体的性腺雄性化性状,这也表明能被NMT-1利用的C14-CoA的水平过低导致了acs-4突变体的性腺雄性化性状。免疫荧光实验还发现FEM-3蛋白在acs-4/HT2杂合体中能成簇(cluster)形成聚集的小点,但是在acs-4纯合突变体中FEM-3扩散不能成簇形成小点。许多脂酰修饰蛋白质都有成簇现象,这暗示FEM-3很可能被C14脂酰修饰。根据以上实验数据,本文提出模型认为：在acs-4突变体中,acs-4的失活导致NMT-1没有足够的C14-CoA底物可用来修饰蛋白质(很可能是FEM-3),不被C14脂酰修饰的蛋白质直接或间接的导致了FEM-3不能在膜上成簇,从而引起acs-4雌雄同体突变体的性腺被雄性化,不能产生卵细胞。本文首次发现了脂酰修饰影响性别决定信号通路,这是全新的性别决定调控机制；此外本文通过改变脂肪酸代谢来影响脂酰修饰既而改变性别决定,这对脂肪酸代谢影响生命活动的机制有了新的诠释。
【作者】唐鸿云；
【导师】龚兴国；杨卫军；
【作者基本信息】浙江大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】acs-4；fem-3；tra-2；fog-1；fog-3；脂酰辅酶A合成酶；性别决定；N-C14脂酰修饰蛋白质；

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