烤烟K326与香料植物间作下原核微生物多样性及部分菌株功能酶筛选研究

【摘要】烤烟是我国重要的经济作物,由于烤烟存在连作障碍,导致单作的产量较低以及品质较差,进而制约了我国经济的发展。本研究以烤烟为研究对象,分析烤烟与不同香料植物间作类型旺长期、稳定期、采摘后期原核微生物群落变化,从中发掘有应用潜力的菌种资源和新物种资源。本研究采用纯培养和免培养的手段对烤烟不同间作类型的原核微生物进行研究。首先用BiologECO板的方法,对不同时期的五种间作类型下的间作烤烟及非间作对照烤烟根际微生物的31种碳源利用进行检测,根据碳源利用情况来判断微生物的代谢功能多样性。结果表明：间作增加了烤烟根际微生物的代谢功能多样性,五种间作类型的烤烟与单作对照组相比代谢功能多样性增强；对不同生长时期进行比较,除香叶天竺葵植物间作烤烟外,其他间作类型的微生物代谢功能多样性在稳定期最高,选用成熟香叶天竺葵植物间作比较好；甜罗勒植物间作类型比较适合一年烤烟种植,因为在旺长期和稳定期微生物代谢功能多样性较高；香茅草、薄荷的间作类型不仅在旺长期和稳定期都保持较高的微生物代谢功能多样性,而且在采摘后期微生物的代谢功能多样性依然很高,对于改善烤烟连作障碍具有重要意义。采用纯培养的分离方法,根据BiologECO板测定的偏好型碳源底物及烤烟植物特征自主设计适合本研究材料的分离培养基,从旺长期的五种间作类型的土样中共分离到1032株微生物,共分布于76个属205个种。从稳定期五种间作类型的图样中共分离到914株原核微生物,分82个属219个种。采摘后期的五种间作类型土壤中共分离到368株原核微生物,分布于43个属89个种。综合分析：博斯氏菌属(Bosea)、糖单孢菌属(Saccharomonospord)、卡斯特罗尼氏菌属(Castellaniella)、韩国生工菌属(Kribbella)、野野村菌属(Nonomuraea)、多态放线菌属(Actinopolymorpha)、糖丝菌属(Saccharothrix)、链孢子囊菌属(Streptosporangium)、冢村菌属(Tsukamurella)、原小单胞菌属(Promicromonospora)、鞘氨醇盒菌属(Sphingopyxis)、马杜拉放线菌属(Actinomadura)、伦茨氏菌属(Lentzed)、小月菌属(Microlunatus)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、薄层菌属(Hymenobacter)、气微菌属(Aeromicrobium)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)18个属为首次在烤烟根际土中分离出来。计算不同间作类型各样点香农指数,结果表明：烤烟的种植改变了原有土壤中的微生物菌群分布；不同的间作类型与单作对照组相比,根际微生物的菌群分布不同;样点的香农指数较高,说明本实验设计的培养基和分离方法比较有利于对烤烟间作样点微生物的分离；稳定期的香农指数比旺长期稍高,就纯培养来说,稳定期微生物的多样性较高,其中迷迭香、香茅草、香叶天竺葵间作烤烟获得的纯培养物的多样性较高,物种资源较丰富。选用稳定期根际土为研究对象,采用高通量测序的方法对不同间作类型植物根际土的微生物进行检测。结果表明：最大的是变形菌门(Proteobacteria),这也和其它环境中的相同,变形菌门在普通环境中所占比例较高。在烤烟根际土中所占比例为50%左右。对照组GCKY所占比例为50.8%,变化比较明显的是：GDY,GCY所占比例较少,分别是：37.7%和44.5%,GAY所占比例较高为：59.9%。第二大类群是放线菌门(Actinobacteria),其他五种间作模式中放线菌门都比对照组变小,其中GBY所占的比例最小,为：14.4%。第三大类群属于细菌域潜在的新门级水平,所占的比例相对也比较高,平均为14.2%,其中对照组为：11.9%,GAY比对照组低,为9.9%,其他都比对照组要高,其中GDY所占比例高达21%。酸杆菌门(Acidobacteria),平均所占比例为5.2%,对照组4.6%,GAY所占比例较少2.0%GDY,GCY所占比例较高,分别是6.9%、6.7%。拟杆菌门(Bacteroidetes)占3.0%;厚壁菌门(Firmicutes)占2.4%,芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)占2.3%；绿弯菌门(Chloroflexi)占1.8%；Verrucomicrobia疣微菌门占0.8%；未分类单元TM7占0.9%；硝化螺旋菌门(Nitrospira)占0.5%,其中对照组为0.3%,GAY较少为2%,GDY,GDY都为0.4%,GCY,GEY分别是1.0%,0.7%香农指数计算结果为GAY7.872、GBY9.405、GCY9.324、GDY10.779、GEY9.102、GCKY9.117。迷迭香与香茅草间作模式下烤烟的微生物多样性指数最高。以稳定期植物为研究对象,从五种间作类型的植物中共分离到704株微生物,共分布于65个属136个种,其中从烤烟植物中共分出266株微生物,分布于40个属的96个种,其中冢村菌属(Tsukamurella)鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)微杆菌属(Microbacterium)、短波杆菌属(Brevibacterium)无色小杆菌属(Achromobacter)短芽胞杆菌属(Brevibacillus)糖丝菌属(Sphingopyxis)微球菌属(Micrococcus)、剑菌属(Ensifer)、红球菌属(Rhodococcus)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)小陌生菌属(Advenella)、短小杆菌属(Curtobacterium)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、罗氏菌属(Rothia)鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonus)微胞菌属(Microcella)、短波单胞菌属(Brevundimonas)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、贪食菌属(Variovorax)、亮杆菌属(Leucobacter)、德沃斯氏菌属(Devosia)、考克氏菌属(Kocuria)、小短杆菌属(Brachybacterium)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、类诺卡氏菌属(Nocardioides)、涅斯捷连科氏菌属(Nesterenkonia)、动孢放线菌属(Actinokineospora)、农球菌属(Agrococcus)及3个潜在新属为首次在烤烟植物内分离出来。随机选取部分菌株对其溶磷、利用烟碱、固氮、耐重铬离子、产铁载体、淀粉水解等方面酶活进行检测,发现了大量在农业生产及后续烤烟加工中有重要应用潜力的微生物资源。土壤微生物与植物之间存在着紧密的联系,不仅能够增强植物的抗逆性也能为植物选择性地提供各种营养,降解施肥或者农药施用时产生的污染类物质,对于植物及维持土壤的健康都具有重要作用。本研究以云南石林印象山庄的K326烤烟为研究对象,探索在五种不同间作模式下的烤烟根际土微生物的变化趋势,揭示了烤烟不同间作模式下根际土微生物的菌群分布情况及微生物的代谢功能的变化规律。从微生物多样性的角度解释了比较合适的间作类型。对研究烤烟生态群落变化选择合适的间作了性提供了理论依据和技术支持。对于选择合适的间作类型,提高烤烟的产量及质量具有重要意义。从根际土及植物内分离到大量的微生物资源,通过对部分菌株的部分酶活进行检测,挑选出了一批可以在烤烟的种植与加工有应用潜力的菌株。不仅为进一步筛选功能菌株提供了丰富的菌种来源而且为后续农业生产及工业用于提供了宝贵的菌种资源。
【作者】刘冰冰；
【导师】张利莉；
【作者基本信息】东北农业大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】烤烟；香料植物；间作；原核微生物；多样性；功能酶；

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