SENEX基因调控外周Treg细胞凋亡的临床和实验研究

【摘要】调节性T细胞(RegulatoryTcells,Treg)在维持机体自身免疫耐受、免疫自稳平衡中起关键作用。Treg细胞功能数量的亢进或缺失将导致不同类型的免疫紊乱。一方面,Treg细胞过度累积、功能亢进会导致机体罹患恶性肿瘤等疾病的风险大大增加；而另一方面,Treg细胞数量功能缺陷又参与自身免疫性疾病的发生发展。研究表明,细胞凋亡是决定外周Treg细胞数量的关键因素,但其确切机制未明。SENEX基因是新发现的、调控细胞凋亡的重要基因,其对外周Treg细胞凋亡的作用,目前未见相关报道。预实验中,我们发现恶性肿瘤患者Treg细胞中SENEX基因表达特异性上调,而自身免疫性疾病患者外周血SENEX基因表达显著下调。因此,我们提出”SENEX基因是调控Treg细胞凋亡的新基因”的假说,从Treg细胞免疫抑制亢进(恶性肿瘤)和免疫抑制缺陷(自身免疫性疾病)两个不同方面,全面评估了SENEX基因在调控Treg细胞凋亡中的重要作用。本课题首先分析了自身免疫性疾病、膀胱癌两种不同类型患者中Treg细胞表达情况,并初步分析Treg表达变化的临床意义,从正反两个方面诠释了外周Treg细胞在机体免疫系统中的重要作用；其次,我们检测了自身免疫性疾病、膀胱癌患者外周血Treg细胞中SENEX基因及相关促凋亡的表达情况,结果表明SENEX基因上调可能是外周Treg细胞数量增加的原因,而SENEX基因表达下调与Treg细胞减少相关,提示SENEX基因可能通过多种途径调控Treg细胞凋亡；最后,我们使用流式分选的Treg细胞进行原代培养,应用RNA干扰等技术证实,SENEX基因通过抑制促凋亡基因表达,拮抗外周Treg细胞凋亡。总之,本课题以外周Treg细胞凋亡调控新基因为切入点,全面分析了不同类型患者中Treg细胞表达特点,从正反两个方面证实了SENEX基因对外周Treg细胞凋亡的重要调控作用。本课题主要包括以下三个方面的研究内容：第一部分自身免疫性疾病、膀胱癌患者外周血Treg细胞和相关细胞因子检测及其临床意义目的：检测健康人群、自身免疫性疾病及初诊膀胱癌患者外周血中调节Treg细胞的比例、FoxP3基因mRNA水平及细胞因子TGF-β1、IL-10、IL-2、IL-17及TNF-α表达水平,同时探讨Treg细胞、FoxP3基因表达与膀胱癌肿瘤临床分期的相关性。方法：收集23例初诊自身免疫性疾病患者、38例初诊膀胱癌患者、34例老年健康志愿者和36例青年健康志愿者外周血,留取血清,密度梯度离心分离出单个核细胞。以CD4+CD25+CD127low作为Treg细胞的分子标记,分别应用流式细胞术(FlowCytometry,FC)、QRT-PCR及ELISA方法检测上述标本中Treg细胞的比例、FoxP3mRNA表达及血清细胞因子TGF-β1、IL-10、IL-2、IL-17和TNF-α的浓度。结果：1.SLE和RA患者外周血Treg细胞比例显著降低：SLE(3.12±0.35%)与RA(2.98±0.31%)患者外周血Treg细胞比例较老年对照组(7.14±0.41%)及青年对照组(5.09±0.37%)均显著降低,组间比较经统计学分析差异有显著意义。2.膀胱癌患者及老年对照组外周血Treg细胞比例显著增高：与青年对照组(5.09±0.37%)相比较,膀胱癌组及老年健康对照组的外周Treg细胞比例显著增加,分别为(10.67±0.58%)和(7.14±0.41%)；同时,膀胱癌患者外周血Treg水平较老年健康对照组明显增加,经统计学分析两组间差异有统计学意义。3.SLE和RA患者外周血FoxP3基因mRNA表达显著降低：与老年健康对照组及青年健康对照组比较,SLE(2-△△CT=0.0063±0.0041)及RA(2-△△CT=0.0071±0.0048)患者FoxP3基因mRNA表达显著降低,组间差异经统计学分析有统计学意义(p<0.05)。4.膀胱癌患者外周血FoxP3基因mRNA表达显著增加：膀胱癌患者外周血FoxP3基因mRNA表达(2-△△CT=0.0272±0.0081)要显著高于青年健康对照组(2-△△CT=0.0097±0.0039)及老年健康对照组(2-△△CT=0.0184±0.0059),差异均有统计学意义(p<0.05)。老年健康对照组FoxP3基因mRNA表达与青年健康对照组比较,差异无统计学意义(p=0.241)。5.RA患者外周血多种细胞因子分泌失调：与健康青年及老年对照组比较,RA患者血清IL-10(14.89±1.07pg/m1)浓度显著升高,差异有统计学意义。与健康青年对照组比较,RA患者血清IL-2(565.73±38.07pg/m1)和IL-17(18.86±4.72pg/ml)浓度显著升高,而血清TGF-β1(6.19±2.08ng/ml)水平显著降低,差异均有统计学意义(p<0.05)。SLE组细胞因子浓度经统计学分析,与健康老年对照组及健康青年对照组均无显著差异。6.膀胱癌患者外周血多种细胞因子分泌紊乱：与健康青年及老年对照组比较,膀胱癌患者血清IL-10(13.03±2.16pg/ml),IL-17(18.29±3.45pg/ml),TGF-β1(16.22±3.35ng/ml)及TNF-a(25.18±5.74pg/ml)浓度均显著升高,差异有统计学意义。同时,膀胱癌患者(165.29±26.45pg/m1)及健康老年对照组(196.69±32.38pg/m1)血清IL-2浓度较健康青年对照组(409.24±90.81)明显减少。此外,膀胱癌患者与健康老年对照组血清IL-2浓度差异无统计学意义(p=0.383)。7.膀胱癌外周血Treg细胞及Foxp3基因表达水平与肿瘤分期相关：21例70岁以上(含70岁)膀胱癌患者的外周血Treg细胞比例平均为12.38%,显著高于70岁以下患者(Treg细胞比例平均为8.96%),两组间比较差异有统计学意义(p=0.017)。同时,外周血Treg细胞比例与肿瘤浸润明显相关,TisT1Ta期膀胱癌患者Treg细胞比例(9.25%)要显著低于T2-T4期患者(12.13%),差异有统计学意义(p=0.006)。21例70岁以上(含70岁)膀胱癌患者的外周血FoxP3基因表达(2-△△CT=0.0368)要显著高于70岁以下患者(2-△△CT=00176),两组间比较差异有统计学意义(p=0.024)。TisTiTa期患者外周血外周血FoxP3基因表达(2-△△CT=0.0155)明显低于T2-T4期患者(2-△△CT=0.0389),差异有统计学意义(p=0.043)。此外,有淋巴结浸润的膀胱癌患者,其外周血FoxP3基因表达(2-△△CT=0.0358)较无淋巴结浸润患者(2-△△CT=00186)显著增加(p=0.026)。结论：SLE及RA患者外周血Treg细胞比例及FoxP3基因水平显著降低；胱癌患者外周血Treg细胞及FoxP3基因表达水平显著增加,同时其体内存在多种细胞因子分泌紊乱；Treg细胞及FoxP3基因表达与膀胱癌肿瘤浸润明显相关,存在统计学相关性。因此,外周血CD4+CD25+CD127l0wTreg细胞是维持机体免疫自稳平衡的关键因素。一方面,其数量缺陷可诱发机体过度免疫应答,参与自身免疫性疾病的发生；另一方面,过度累积的Treg细胞通过细胞因子分泌等方式,过度抑制了机体的免疫反应,又促进了膀胱癌的肿瘤生长、加速肿瘤转移。第二部分自身免疫性疾病、膀胱癌患者SENEX基因及相关凋亡基因的表达特点目的：检测膀胱癌患者、健康志愿者外周血Treg细胞中SENEX基因和促凋亡基因P53、P16、P21及Caspase-3mRNA水平,同时检测健康人群、自身免疫性疾病患者外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)中SENEX基因和促凋亡基因P53、P16、P21及Caspase-3mRNA表达。探讨Treg细胞中SENEX基因mRNA表达与凋亡基因表达、细胞因子浓度之间的相关性。方法：收集23例初诊自身免疫性疾病患者、16例初诊膀胱癌患者、10例老年健康志愿者和12例青年健康志愿者外周血,留取血清,密度梯度离心分离出单个核细胞。应用流式细胞术纯化分选外周血CD4+CD25hiTreg/CD4+CD25-Tefi细胞,采用QRT-PCR方法检测(?)Treg/Teff细胞和PBMCs中SENEX基因和促凋亡基因P53、P16、P21及Caspase-3mRNA的表达水平,使用Pearson相关分析探讨SENEX基因与促凋亡基因mRNA水平及血清细胞因子浓度之间的相关性。结果：1.膀胱癌患者及健康对照组Treg细胞流式细胞分选纯度检测：共有16例膀胱癌患者、12例健康青年志愿者和10例健康老年志愿者成功获得了CD4+CD25hiTreg/CD4+CD25-Teff细胞亚群,经检测提示CD4+CD25+CD127lowTreg细胞纯度均在90%以上。2.膀胱癌患者及健康对照组外周血Treg/Teff细胞中SENEX基因表达特点：与老年健康对照组及青年健康对照组Treg细胞比较,膀胱癌患者外周血CD4+CD25hiTreg中SENEX基因表达显著增加,经统计学分析组间差异有统计学意义(p<0.05)。同时,膀胱癌患者Treg细胞中的SENEX基因表达亦较Teff细胞明显增加。在健康老年对照组及青年对照组,外周血Treg细胞SENEX基因表达均略高于Teff细胞,但经统计学分析差异均显著无意义(p=0.186)。3.膀胱癌患者外周血Treg/Teff细胞中促凋亡基因表达特点：与Teff细胞相比较,膀胱癌患者Treg细胞中凋亡基因P53、P16、P21及Caspase-3的表达均显著减少,经统计学分析组间差异均有显著意义(p<0.05)。4.膀胱癌患者Treg细胞SENEX基因与P53表达、TGF-β1及IL-2浓度相关：SENEX基因mRNA表达与凋亡基因P53mRNA水平、细胞因子TGF-β1和IL-2浓度显著相关,有统计学意义。其中,SENEX基因表达与凋亡基因P53mRNA水平、血清IL-2浓度呈明显负相关,与血清TGF-β1水平呈显著正相关。5.自身免疫性疾病患者PBMCs中SENEX基因表达特点：与老年健康对照组(2-△△CT=0.1130±0.0065)及青年健康对照组PBMCs(2-△△CT=0.1955±0.0482)比较,RA患者PBMCs中SENEX基因表达(2-△△CT=0.0354±0.0015)显著降低,经Mann-WhitneyU检验分析组间差异有统计学意义(p<0.05)。在SLE患者,其PBMCs中SENEX基因表达(2-△△cT=0.0842±0.0281)略低于健康青年对照组及健康老年对照组,但经统计学分析差异均无统计学意义(p=0.452)。6.自身免疫性疾病患者PBMCs中凋亡基因表达特点：与健康老年对照组及健康青年对照组相比较,RA患者PBMCs中促凋亡基因P53和Caspase-3基因的mRNA表达水平均显著增加,经Mann-WhitneyU检验分析组间差异均有统计学意义(p<0.05),而RA患者PBMCs中P16和P21的mRNA表达变化无统计学意义。在SLE患者,其PBMCs中促凋亡基因P53、P16、P21及(Caspase-3mRNA表达水平与健康老年对照组及健康青年对照比较,差异均无统计学意义。结论：RA患者PBMCs中SENEX基因表达下调,而促凋亡基因P53和Caspase-3的表达增加。膀胱癌患者外周血Treg细胞高表达SENEX基因,而促凋亡基因P53、P16、P21及Caspase-3的mRNA表达水平均显著降低。同时,SENEX基因表达与凋亡基因P53、血清TGF-β1及IL-2浓度明显相关。SENEX基因可能通过下调促凋亡基因P53表达,拮抗Treg细胞凋亡,促进其在膀胱癌患者外周血中的累积。此外,SENEX基因表达上调还增加膀胱癌患者TGF-β1水平,抑制IL-2分泌。因此,SENEX基因是参与调控外周Treg细胞凋亡的新基因。第三部分SENEX基因拮抗外周CD4+CD25hiTreg细胞凋亡的体外实验研究目的：检测膀胱癌患者外周血Treg/Teff细胞在体外短期原代培养时的自发细胞凋亡率,观察氧化应激损伤对Treg/Teff细胞凋亡的影响,研究SENEX基因mRNA表达对Treg/Teff细胞凋亡的影响,探讨SRNA-SENEX转染对Treg细胞促凋亡基因mRNA表达的影响。观察RA患者PBMCs原代培养时自发凋亡特点,研究SENEX基因RNA干扰对RA患者PBMCs凋亡的影响。方法：收集4例健康志愿者、5例初诊类RA患者和5例初诊膀胱癌患者外周血,留取血清,密度梯度离心分离出单个核细胞。应用流式细胞术纯化分选外周血CD4+CD25hiTreg/CD4+CD25-Teff细胞,并在体外进行短期原代培养,采用100μMH202溶液诱导氧化应激性损伤。应用RNA干扰技术特异性抑制Treg/Teff细胞中SENEX基因表达,采用QRT-PCR方法检测Treg/Teff细胞中SENEX基因和促凋亡基因P53、P16、P21及Caspase-3mRNA的表达水平,使用流式检测AnnexinV(+)凋亡细胞比例。应用RNA干扰技术特异性抑制RA患者PBMCs中SENEX基因表达,观察SENEX基因表达受抑对PBMCs细胞凋亡的影响。结果：1.膀胱癌患者Treg/Teff细胞原代培养24h自发凋亡检测：在相同培养条件下,经24h短期培养,膀胱患者外周血Treg细胞自发凋亡率(AnnexinV+细胞比例：3.53±0.17%)要显著低于Teff细胞(5.78±0.46%),实验结果表明膀胱癌外周Treg细胞具有凋亡抵抗的特征。2.不同剂量H202诱导Treg/Teff细胞凋亡检测：不同剂量H202对Treg和Teff细胞均有不同程度的凋亡诱导作用,H202诱导的Treg/Teff细胞凋亡具有剂量-效应关系,在25μM、50μM、100μM及150μMH2O2处理Treg细胞2h时后,即刻检测其凋亡率分别为：4.3±0.32%、4.9±0.48%、5.7±0.41%及9.7±0.95%；而25μM、50μM、100μM及H2O2处理Teff细胞2h时后,其凋亡率分别为：5.1±0.53%、5.7±0.76%、6.8±0.75%及11.7±1.04%。相同剂量H202诱导细胞凋亡时,Teff细胞的诱导凋亡率均高于Treg细胞,差异有统计学意义。3.SENEX基因RNA干扰细胞模型的建立：体外构建了SENEX基因SiRNA转染Treg/Teff细胞模型后,real-timePCR检测结果提示,在使用脂质体LipofectaininTM2000转染SiRNA-SENEX时,Treg和Teff细胞中SENEXmRNA表达抑制率均达到80%以上。4.SENEX基因可以拮抗H202诱导的Treg细胞凋亡：使用100μMH2O2处理2h,可显著增加膀胱癌患者Treg和Teff细胞凋亡率(分别为11.2±2.6%和13.1±4.3%)；同时在相同的处理条件下,SENEX-SiRNA转染可显著增加Treg细胞凋亡率(21.5±3.4%)；而在Teff细胞(13.9±3.1%)中,则没有观察到由SENEX基因介导的抗凋亡作用。5.SiKNA-SENEX转染显著增加Treg细胞中凋亡基因mRNA表达：使用100μMH202处理2h诱导细胞凋亡时,在RNA干扰特异性抑制SENEX基因表达24h后,检测(?)Treg细胞中相关凋亡基因的表达情况。结果表明,使用RNA干扰抑制SENEXmRNA的表达,会显著增加Treg细胞中P53、p16、P21及Caspase-3mRNA(2-△△CT=6705.73±1124.07、253.08±16.0、154.58±35.12及5135.79±985.47)的表达。6.初诊RA患者PBMCs自发凋亡率检测：在相同培养条件下,经24h短期培养,初诊RA患者PBMCs自发凋亡率(AnnexinV+细胞比例：4.96±0.31%)要显著高于健康志愿者PBMCs(3.75±0.36%),实验结果表明初诊RA患者PBMCs自发凋亡率显著增加。7.不同剂量地塞米松诱导PBMCs凋亡检测：不同剂量地塞米松对RA患者PBMCs均有不同程度的凋亡诱导作用,地塞米松诱导的PBMCs凋亡具有剂量-效应关系,在0×(5×10-2)mg/L、1×(5×10-2)mg/L、2×(5×10-2)mg/L、5×(5×10-2)mg/L、10×(5×10-2)mg/L、50×(5×10-2)mg/L及100×(5×10-2)mg/L地塞米松处理RA患者PBMC24h时后,即刻检测其细胞凋亡率分别为：19.0±4.18%、21.4±3.95%、22.9±4.99%、23.4±5.48%、23.9±5.17%、23.5±5.11%及23.8±5.32%；而0×(5×10-2)mg/L、1×(5×10-2)mg/L、2×(5×10-2)mg/L、5×(5×10-2)mg/L10×(5×10-2)mg/L、50x(5×10-2)mg/L及100×(5×10-2)mg/L地塞米松处理健康志愿者PBMC24h时后,其凋亡率分别为：16.3±3.76%、18.5±4.21%、19.3±5.07%、20.1±4.12%、19.9±4.02%、20.6±3.29%及20.2±4.28%。结果显示,相同剂量地塞米松诱导PBMCs凋亡时,RA患者的细胞凋亡率要显著高于健康志愿者,进一步说明RA患者PBMC;更易发生细胞凋亡。8.SiRNA-SENEX转染显著增加地塞米松诱导的PBMCs凋亡：使用5×10-2mg/L地塞米松处理8h,可显著增加RA患者和健康志愿者PBMCs细胞凋亡率(分别为6.1±2.75%和5.2±1.04%)；而在相同的处理条件下,SENEX-SiRNA转染可同时显著增加RA患者(13.5±2.86%)和健康志愿者(10.6±2.95%)的PBMCs细胞凋亡率。结论：无论是自发凋亡还是H202诱导的氧化应激性损伤时,膀胱癌Treg细胞均较Teff细胞凋亡减少,具有凋亡抵抗的特征。使用RNA干扰抑制SENEX基因mRNA表达,会显著增加Treg细胞氧化应激损伤的凋亡率。SENEX基因通过抑制促凋亡基因表达,抑制膀胱癌患者外周血Treg细胞凋亡,促进外周血Treg细胞比例的增加,从而为肿瘤的发生、发展及免疫逃逸提供有利的免疫微环境。此外,SiRNA-SENEX转染进一步增加RA患者PBMCs细胞凋亡,亦从反面佐证了SENEX基因调控Treg细胞凋亡的结论。SENEX基因有望成为外周Treg细胞免疫干预的潜在靶点,相关研究为自身免疫性疾病、恶性肿瘤的临床防治开启了新的思路。
【作者】陈天平；
【导师】翟志敏；
【作者基本信息】安徽医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】调节性T细胞；RNA干扰；SENEX基因；细胞凋亡；免疫自稳；

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