DYNLT1丝氨酸82位点模拟磷酸化对缺氧细胞微管和mPTP的调节作用及机制研究

【摘要】严重烧（创）伤后早期即可导致心脏、胃肠道等组织脏器的缺血缺氧，其发生发展严重影响伤情转归及预后。缺氧细胞早期即可发生能量代谢障碍，其中线粒体损伤是核心环节。微管在细胞中起着支架作用，同时与线粒体之间存在密切的功能联系。缺氧可以导致微管解聚和线粒体膜通透性增加，影响细胞能量代谢并引发凋亡。动力蛋白作为微管和线粒体之间的桥梁分子，发挥着除货物运输之外的其他作用。前期研究发现，动力蛋白轻链1（DYNLT1）和线粒体电压依赖性阴离子通道（VDAC）之间存在共定位和蛋白相互作用，可能是新的线粒体膜通透性调控分子，其低表达可加重线粒体对于缺氧损害的敏感程度，但机制不明。根据前期研究和相关文献报道，缺氧可激活p38/MAPK通路并磷酸化微管相关蛋白，而DYNLT1位点S82的磷酸化可影响动力蛋白形成及其货物输送能力。据此，我们推测：缺氧可能导致DYNLT1的磷酸化，并对微管和线粒体功能产生影响。本课题旨在研究缺氧时DYNLT1的磷酸化变化对于微管和线粒体的影响，选取S82位点采用位点突变手段模拟过磷酸化和去磷酸化，观测其对于微管聚合/解聚平衡、线粒体通透性转换、细胞能量代谢的影响，以进一步探明缺氧病理损害的机制以及动力蛋白的结构功能，以期为减轻细胞缺氧损害寻找新靶点。一、材料与方法1、首先验证缺氧环境下DYNLT1的磷酸化改变并建立S82位点突变的细胞模型。采用免疫共沉淀（IP）、Westernblot法观测缺氧时H9c2和HeLa细胞中DYNLT1的丝氨酸磷酸化程度；在此基础上构建S82位点的磷酸化抗体（anti-phospho-S82），检验不同缺氧程度导致的S82磷酸化变化；通过基因位点突变技术将S82分别突变为谷氨酸模拟过磷酸化状态（S82E）、突变为丙氨酸模拟去磷酸化状态（S82A），包装重组腺病毒（Ad-S82E/S82A）后分别转染H9c2/HeLa细胞株使其稳定表达，为后续实验建立模拟磷酸化的细胞模型。2、采用Westernblot法定量检测和免疫荧光显微技术的形态学观察，从两方面检验不同程度磷酸化调节的DYNLT1对于缺氧微管结构的影响。首先检测缺氧时胞质内聚合态（Ploymeric）与非聚合态（Monomeric）微管蛋白的含量变化；再利用Ad-S82E/S82A腺病毒分别转染H9c2/HeLa，对比不同磷酸化修饰的DYNLT1对于缺氧时微管解聚（tubulin定量和镜下微管网状结构观测）的影响。3、同法建立上述转染细胞缺氧模型后，荧光显微镜下对比观察不同S82模拟磷酸化状态对于线粒体膜通透性mPT的影响。采用酯化钙黄绿素(Calcein-AM)和氯化钴(CoCl2)共孵育的方法检测mPTP的开放情况；采用四甲基罗丹明乙酯（TMRE）荧光染色法检测线粒体膜电位MMP的变化；Westernblot法检测各组Cytc的漏出。4、同法建立转染后H9c2/HeLa细胞缺氧模型，检测S82位点突变对于细胞能量代谢的影响：CCK-8法检测细胞活力、各组胞浆ATP含量和生成率。5、从常氧、缺氧正反两方面论证来探寻可能的S82位点磷酸化信号调节通路：p38/MAPK。首先验证缺氧可激活p38/MAPK信号通路；采用p38抑制剂SB203580检测缺氧时对pS82的抑制作用；通过MKK6重组腺病毒转染从上游激活p38，检测常氧时对pS82表达的上调作用。二、主要结果与结论1、缺氧可导致DYNLT1发生磷酸化改变。H9c2/HeLa细胞缺氧0.5h、1h、3h、6h时，均发现DYNLT1发生了丝氨酸磷酸化，呈早期增强、后期降低的趋势，峰值最早出现在缺氧1h。S82位点的缺氧磷酸化变化与此相同。针对S82位点采用腺病毒转染方法成功设计了S82E/S82A突变，分别模拟过磷酸化和去磷酸化状态。2、缺氧可破坏微管聚合/解聚平衡使之向解聚倾斜。S82E模拟过磷酸化可加重缺氧细胞的微管解聚，表现为游离微管蛋白增多，微管网状结构排列松散、荧光强度降低；S82A模拟去磷酸化可减轻缺氧导致的微管结构破坏，对于微管结构具有保护作用。3、缺氧可诱导mPTP开放增加，导致线粒体功能障碍。S82E模拟过磷酸化加重了缺氧后的MMP下降，使mPTP开放和Cytc从线粒体内漏出增加。S82A对于缺氧后的mPTP开放有一定的遏制作用。4、缺氧后线粒体功能障碍直接导致能量代谢障碍。不同磷酸化修饰对胞浆ATP含量未见明显影响，但S82E可降低线粒体ATP合成率，而S82A对线粒体ATP合成率无明显改善作用。5、实验发现缺氧使p38/MAPK通路激活，抑制p38可下调缺氧时pS82的表达，而激活p38可上调常氧时pS82的表达，说明p38/MAPK通路参与了DYNLT1的S82磷酸化调节。
【作者】徐雪；
【导师】朱京慈；
【作者基本信息】第三军医大学，护理学，2014，博士
【关键词】动力蛋白轻链1；微管；线粒体；线粒体通透性转换；磷酸化；

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