67LR蛋白通过调控LOXL2表达促进胆管癌细胞侵袭转移的研究

【摘要】研究背景与目的胆管细胞癌是一种死亡率极高的恶性肿瘤，早期沿胆管神经纤维侵润和远处器官转移是其主要的生物学特性。虽然外科手术切除为胆管癌患者提供了一种良好的治疗机会，但是大部分病人在手术后两年内出现肿瘤复发，手术后五年生存率仅为5%-15%。虽然在胆管癌的诊断、术前评估、围手术期管理及术后治疗等方面取得了进展，但是胆管癌患者手术后的预后却变化很大。因此，深入研究胆管癌侵袭转移分子机制、寻找更有价值的新的肿瘤标志物具有重要的意义，并将有利于胆管癌患者术后治疗及干预。大量的研究证实67LR与多种肿瘤的侵袭转移相关。我们前期的研究证实67LR在胆管癌组织中高表达并促进胆管癌细胞体外侵袭能力。67LR是一种与其配体Laminin(LN)高度亲和的细胞表面受体。67LR与LN结合后，介导肿瘤细胞与基底膜结合并启动细胞内信号传导，进而促进肿瘤细胞侵袭转移能力。虽然有研究提示67LR在肿瘤的发展过程中促进了MMP-2表达，然而，67LR促进肿瘤侵袭转移能力的机制还没有完全研究清楚。一项最近的研究提示67LR可能参与了囊腺瘤细胞的上皮间叶样转化，β-catenin的调控以及迁徙能力。我们前期的研究发现赖氨酰氧化酶样蛋白2(LOXL2)在胆管癌组织中高表达，并通过诱导EMT促进胆管癌细胞体内外的侵袭能力。同时，多项研究提示LOXL2在乳腺癌、大肠癌，食管癌等多种肿瘤中高表达，并证实LOXL2是EMT的关键促发因子，诱导肿瘤细胞从相对稳定的上皮细胞状态转化为运动能力增强的间叶样细胞。Loxl2在其N端包含四个SRCR的重复序列SRCR结构域出现在细胞表面及分泌性的LOXL2中，其介导细胞间的相互作用、细胞粘附及信号传导。这些研究促使我们进一步研究LOXL2在67LR介导的胆管癌细胞侵袭转移过程中的作用。基于以上67LR和LOXL2相似的研究背景，我们推测67LR可能通过激活胆管癌细胞的LOXL2编码基因转录，上调LOXL2蛋白表达，进而提高其侵袭转移能力。我们希望通过本研究明确67LR与LOXL2之间的关系，并初步探索二者在胆管癌转移中的作用及可能的分子机制。材料与方法1，采用免疫组织化学染色的方法，检测73例胆管癌细胞癌组织标本中67LR和LOXL2的表达，并分析二者之间的相关性。收集上述病例的病理学资料，分析67LR、LOXL2表达与CCA临床病理之间的联系。同时明确67LR及LOXL2的表达与CCA患者术后生存时间及肿瘤复发的相关性。2，分别构建67LR和LOXL2基因过表达及干扰重组慢病毒质粒。利用慢病毒质粒感染胆管癌细胞株QBC939和RBE，采用荧光定量PCR和蛋白印迹方法，检测并分析体外细胞实验中67LR及LOXL2的相关性。3，利用LOXL2过表达及干扰慢病毒质粒感染胆管癌细胞系，观察LOXL2蛋白对胆管癌细胞株迁移、侵袭转移能力的影响。4，建立LOXL2沉默QBC939胆管癌细胞系，采用外源性67LR慢病毒质粒进行感染，观察内源性LOXL2表达缺失是否能够阻止外源性67LR的介入所促进的胆管癌细胞迁移、侵袭转移能力。5，体内动物实验中注射LOXL2沉默胆管癌细胞系，观察LOXL2在体内是否能够抑制胆管癌的转移。同时，对EMT的相关指标进行检测，初步探索67LR/LOXL2与EMT的相关性。结果1，73例胆管癌组织标本中，26例(35.62%)67LR表达阳性，24例(32.88%)LOXL2蛋白表达阳性。19(26.03%)例同时表达67LR及LOXL2，两者表达显著相关，p=0.0013。综合分析临床病理特点提示：67LR及LOXL2表达强度与CCA的分化程度、淋巴结转移及TNM分期有关，(P<0.001)；而与患者年龄，性别、肿瘤位置、大小无相关性。67LR及LOXL2表达强度与CAA患者术后生存时间及肿瘤复发时间呈负相关，67LR及LOXL2表达强度与CAA患者预后呈相关性。提示：67LR及LOXL2可作为CAA患者术后生存预后及肿瘤侵袭转移能力的预测指标。2，成功构建67LR和LOXL2重组慢病毒质粒sh-67LR、ex-67LR、sh-LOXL2和ex-LOXL2；体外细胞实验中RT-qPCR和westernblot方法检测67LR和LOXL2转染前后的表达水平变化，验证了67LR与LOXL2表达呈紧密正向相关性。3，LOXL2重组慢病毒质粒高效感染胆管癌细胞后，LOXL2的mRNA和蛋白表达显著上升。划痕实验、侵袭实验和趋化实验均证实，胆管癌细胞运动和侵袭能力显著增强。4，成功筛选出LOXL2稳定沉默的胆管癌细胞系QBC939/LOXL2-/-。转入外源ex-67LR后，正常QBC939细胞组组的细胞迁移、侵袭转移能力较转染前的细胞增强，差异具有统计学意义，p＜0.05；而QBC939/LOXL2-/-胆管癌细胞的迁移和侵袭能力与转染前一致，无统计学差异，p＞0.05。5，体内动物实验验证了体外细胞学实验中的结果，肯定了LOXL2在67LR刺激细胞过程中的关键作用。同时我们对可能涉及的EMT进行检测。RT-qPCR和Westernblot检测均证实EMT的发生。结论1，胆管癌组织中，67LR蛋白的表达与LOXL2蛋白表达密切相关，二者的阳性表均与临床胆管癌细胞分化程度、淋巴结转移及TNM分期相关。67LR及LOXL2表达强度与CAA患者术后生存时间及肿瘤复发时间呈负相关。67LR及LOXL2可以作为CAA术后生存时间的独立预后预测指标。2，67LR正向调控胆管癌细胞QBC939及RBE的LOXL2的表达，而LOXL2无法影响67LR基因的变化。3，外源性LOXL2的干扰和过表达可影响胆管癌细胞的转移、侵袭转移能力。4，LOXL2表达缺失后，外源性67LR无法影响胆管癌细胞的迁移、侵袭转移能力。5，体内实验证实LOXL2沉默后可以有效抑制胆管癌细胞的转移，其机理可能与EMT有关。
【作者】徐敬；
【导师】王曙光；
【作者基本信息】第三军医大学，普通外科学，2014，博士
【关键词】67LR；LOXL2；肝细胞癌；重组慢病毒；癌转移；基因沉默；过表达；

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