酸敏感离子通道1a在肝纤维化星状细胞中的表达、作用及机制研究

【摘要】酸敏感离子通道(acid-sensingionchannels,ASICs)是一类由胞外酸激活的阳离子通道,开放的通道对Na+、Ca2+有通透性,进而引起细胞一系列生理病理变化。目前为止,已发现4个基因编码的7个ASICs亚基(ASIC1a、ASIC1b、ASIC1b2、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3、ASIC4),均属于DEG/ENaC家族成员。近年来ASICs研究备受关注,其不仅在神经系统中存在表达并发挥疼痛、感觉、神经传递等调节作用,还在非神经系统如肿瘤、炎症、缺血性损伤、胃肠道疾病中发挥作用,这些病理反应中共同的特点是局部组织环境酸化、pH值下降,诱发ASICs激活导致Na+、Ca2+内流,进而引起各种病理生理效应。本课题组前期研究发现SD大鼠关节软骨中存在ASIC1a、ASIC2、和ASIC3的表达,在佐剂性关节炎(AdjuvantArthritis,AA)大鼠关节软骨中ASIC1a、ASIC2a和ASIC3的表达均明显高于正常组,ASICs非特异性阻滞剂Amiloride、非甾体类抗炎药阿司匹林能明显抑制。ASICs表达,并对AA大鼠关节软骨具有保护作用。进一步考察ASICs在关节炎中作用机制发现,当大鼠关节炎症发生时,可造成局部关节酸化,ASICs表达增加和通道开放,Ca2+流入关节软骨细胞内,导致关节软骨细胞外基质(Extracellularmatrix,ECM)代谢失衡引起关节软骨损伤。肝纤维化(hepaticfibrosis,HF)是慢性肝病的共同病理过程,是形成肝硬化的中间阶段。目前研究认为,病毒感染和酒精的过量摄入导致肝脏炎症是肝纤维化形成的主因。当炎症刺激时,肝脏产生氧化应激和脂质过氧化损伤,酸性代谢产物增加,肝星状细胞(Hepaticstellatecells,HSCs)活化增殖,转化为肌样成纤维细胞,表达α-SMA,合成和分泌细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)增加,导致ECM的合成与降解失衡,致使过多的ECM在肝组织沉积形成纤维化。该病理进程与关节炎症类似,即同样存在炎症导致的局部酸化,同样引起ECM代谢的失衡,那么,肝脏是否存在ASICs的表达?当肝纤维化时肝组织的酸性代谢会否导致ASICs的表达增加和通道激活,进而发挥其病理生理学作用?为此,我们研究以下内容：LASICla在大鼠肝组织、肝星状细胞的表达分离大鼠肝组织,RT-PCR检测.ASIC1amRNA表达,发现大鼠肝组织中存在ASIC1a的表达,CC14诱导的肝纤维化模型大鼠ASIC1amRNA表达增加；采用ASIC1a,α-SMA免疫荧光双标染色模型组大鼠肝组织,发现大鼠肝组织ASIC1a与α-SMA染色区域高度重叠,提示ASIC1a主要表达与活化肝星状细胞。肝灌注分离正常组、模型组大鼠HSC细胞进行RT-PCR,Westernblot发现,正常组HSCs存在ASIC1amRNA及其蛋白表达,模型组表达高于正常组。选择HSC-T6表型活化细胞株,用酸诱导HSC-T6体外模型(pH6.0),考察不同pH值环境下ASIC1a在HSC-T6的动态表达,研究发现,与pH7.4组相比,pH6.0酸诱导HSC-T6组ASIC1a表达增加。2.ASIC1a阻滞剂Amiloride对CCI4诱导大鼠肝纤维化的保护作用建立CC14实验性肝纤维化大鼠模型,灌胃给予不同剂量ASIC1a阻滞剂阿米洛利(Amiloride,10,5,2.5mg/kg),观察Amiloride对大鼠肝纤维化的影响,验证ASIC1a在肝纤维化进程中的作用。结果发现,Amiloride能显著抑制肝纤维化大鼠肝、脾指数增加；降低血清中升高的ALT、AST、HA、LN、PCⅢ、CIⅣ;病理组织学显示Amiloride组肝脏组织结构明显改善,肝纤维化增生程度减轻,提示Amiloride对CC14所致大鼠肝纤维化有明显的保护作用。进一步研究发现,Amiloride可以显著抑制肝组织中ASIC1a的表达,降低肝纤维化大鼠血清中IL-1、IL-6的等炎性因子的含量；抑制肝组织中α-SMA、TGF-β1、NFκB和CollagenI的蛋白表达。研究提示,ASICla参与肝纤维化疾病进程,Amiloride对实验性肝纤维化的保护作用可能与其抑制ASIC1a,进而调节HSCs功能有关。3.ASICla对酸诱导HSC-T6细胞内Ca2+浓度、细胞增殖和基质代谢的影响建立酸诱导HSC-T6体外模型,采用Amiloride、ASIC1a特异性阻滞剂PcTX1干预,考察抑制ASICla对HSC-T6细胞胞内Ca2+浓度、细胞增殖及基质代谢的影响。激光共聚焦显微镜、Ca2+成像研究HSC-T6胞内Ca2+的变化发现,pH6.0能明显促进Ca2+流入HSC-T6胞内,Amiloride、PcTX1干预后,Ca2+内流明显减少；MTT法观察ASIC1a阻滞剂对酸诱导HSC-T6的细胞增殖的影响,与pH6.0组相比,Amiloride(200、100、50μM)、PcTX1干预后,HSC-T6细胞生长明显被抑制,且呈剂量效应关系；研究HSC-T6功能的影响,发现与pH7.4组相比,酸处理至pH6.0HSC-T6细胞中α-SMA、TGF-β1、collagenⅠ表达增加,Amiloride、PcTXl干预后α-SMA、TGF-β1collagenI表达降低。进一步观察发现,pH6.0HSC-T6细胞中MMP-13明显降低,TIMP-1明显上调,Amiloride、PcTX1能抑制酸性环境下TIMP-1的增加,升高被降低的MMP-13含量,MMP-9、TIMP-2在酸诱导HSC-T6含量变化不明显。研究提示,ASIC1a参与HSCs功能和代谢过程,当酸刺激下,ASIC1a激活和通道开放,使HSC-T6细胞Ca2+内流增加,进而调节HSC-T6细胞生长和胶原分泌,其调节胶原代谢的过程还与MMP-13、TIMP-1的变化有关。4.MAPK信号通路在ASIC1a调节HSC功能中的作用建立酸诱导HSC-T6体外模型,采用ASIC1a非特异性阻滞剂Amiloride、ASIC1a特异性阻滞剂PcTX1、p38MAPK阻断剂SB203580、ERK1/2阻断剂PD98059干预,考察MAPK信号通路在ASIC1a调节HSC功能中的作用。研究结果显示,ASIC1a激活可影响大鼠HSC-T6细胞磷酸化p38MAPK和磷酸化ERK1/2蛋白表达;Amiloride、PcTX1、p38MAPK阻断剂SB203580、ERK1/2阻断剂PD98059不同程度抑制p38MAPK和磷酸化ERKl/2蛋白表达；进一步研究发现,p38MAPK阻断剂、ERK1/2阻断剂不影响酸诱导HSC-T6细胞中Ca2+的流入,但p38MAPK阻断剂、ERK1/2阻断剂均能降低collagenImRNA的表达,其调控机制与p38MAPK调控MMP-13、ERK调控TIMP-1的表达水平有关。结果提示胞外酸化激活ASIC1a通过激活Ca2+依赖的ERK调控TIMP-1的代谢和Ca2+依赖的p38MAPK调控MMP-13的代谢发挥HSC-T6胶原代谢的调节作用。小结：肝组织、HSC细胞中存在ASICla表达,模型组大鼠肝组织、HSC细胞ASICla表达升高；阻滞ASICla对肝纤维化有保护作用；ASICla参与HSCs功能和胶原代谢过程,当ASICla激活时,可增加HSC的Ca2+内流,进而促进HSC细胞因子TGB-∞1生成和胶原分泌,同时TIMP-1上调,MMP-13下降,抑制胶原降解；MAPK信号通路参与ASICla调节HSC胶原代谢的过程。
【作者】吴繁荣；
【导师】陈飞虎；
【作者基本信息】安徽医科大学，药理学，2013，博士
【关键词】酸敏感离子通道1a；肝纤维化；细胞因子；肝星状细胞；活化；增殖；基质金属蛋白酶；基质金属蛋白酶抑制剂；丝裂原激活的蛋白激酶；

【参考文献】
[1]王娟.强Gorenstein同调模的一些推广[D].安徽大学,基础数学,2014,硕士.
[2]李秀华.《九尾龟》研究[D].陕西理工学院,中国古代文学,2014,硕士.
[3]李志富.层板胶合木轴心受压构件稳定性试验和承载力分析[D].重庆大学,土木工程,2014,硕士.
[4]袁学敏.基于模型与GIS的小麦精确栽培方案生成技术研究[D].南京农业大学,作物栽培学与耕作学,2012,硕士.
[5]雷燕.不同客体无关特征信息在视觉工作记忆中加工存储方式及负荷效应探讨[D].西南大学,应用心理学,2013,硕士.
[6]王多蓝.通辽蒙古族中学教务管理系统设计与实现[D].吉林大学,软件,2013,硕士.
[7]龙吟.氧化石墨烯的药物负载与释放规律研究[D].国防科学技术大学,2012.
[8]王会.当下媒体过度报道现象研究[D].湖北大学,新闻,2012,硕士.
[9]白丽清.我国存贷款基准利率的调整对股票价格影响的分析[D].山西财经大学,金融学,2013,硕士.
[10]狄向东.大情字井CO_2输送及注入工艺研究[D].东北石油大学,油气储运工程,2013,硕士.
[11]余长威.长非编码RNA Gtl2在小鼠胚胎发育早期的表达调控及功能研究[D].哈尔滨工业大学,生物学,2014,硕士.
[12]吴瑶.铁（III）-羧酸盐体系光降解水中HBCD的研究[D].华中科技大学,建筑与土木工程,2013,硕士.
[13]刘华.网络环境下HE集团会计信息系统问题研究[D].西北工业大学,2002.
[14]张羽.基于GSO算法的成套订单调度问题研究[D].太原科技大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[15]胡玲.物流管理信息系统开发与应用的研究[D].西南交通大学,交通运输规划与管理,2003,硕士.
[16]王自涛.胃癌伴发病与术后近期并发症关系的分析[D].河北医科大学,外科学,2014,硕士.
[17]范超.我国高速公路收费确定问题研究[D].河北经贸大学,产业经济学,2012,硕士.
[18]洪晶,柳炳祥,程功勋.一种基于Apriori算法的彩票数字组合数据挖掘[J].福建电脑,2005,09:92.
[19]郭树祥.火成岩发育区的地震处理技术及需求分析——以胜利油田济阳拗陷探区为例[J].石油地球物理勘探,2013,02:228-238+332+158.
[20]鲍恩东.鸡马立克氏病胚胎免疫的研究[D].南京农业大学,1995.
[21]迟洪影.胺基材料吸附脱附铀酰离子性能研究[D].中国科学院研究生院（上海应用物理研究所）,高分子化学与物理,2014,硕士.
[22]孙涛,陈桦,曹巨江,张洲平.20kW电子束炉的控制系统设计与应用[J].冶金自动化,2003,06:38-41.
[23]国丽娟.Bioglass@CNF中生物活性玻璃纳米粒子的成核生长行为及生物学性能的研究[D].北京化工大学,材料科学与工程,2013,硕士.
[24]王建涛.基于BP神经网络和“改进加权随机数法”的螺旋曲面加工精度预测的虚拟检测系统构建[D].华侨大学,机械电子工程,2014,硕士.
[25]任科英.实验室岩心声学速度测试中的频散现象[J].石油地球物理勘探,2011,05:779-782+836+665.
[26]熊金林.基于共生模式的“城中村”环境问题改造[D].西安建筑科技大学,艺术设计,2013,硕士.
[27]胡金润.自适应无网格伽辽金拓扑优化方法研究[D].三峡大学,机械工程,2013,硕士.
[28]江华,赵文庆,付丽萍,李路梅,李建军.联村集中供水工程中存在的问题及对策[J].河北水利.2008(05)
[29]郭靖.7-【5-（3-三氟甲基-4-异丙氧基苯基）-2-1，3，4-噁二唑基】-2-氨基-1，2，3，4-四氢-2-萘甲醇的合成[D].吉林大学,药物化学,2013,硕士.
[30]张圆.《纽约公约》下已撤销外国商事仲裁裁决的承认与执行[D].复旦大学,国际法,2012,硕士.
[31]黄志贵.微生物菌剂对煤矿区土壤生产力的调控研究[D].西安科技大学,环境工程,2014,硕士.
[32]李政杰,吕伟,李宝华,康飞宇,杨全红.片状锡在石墨烯薄膜层间纳米空间的限域制备及其电化学性能研究[A].中国化学会.中国化学会第29届学术年会摘要集——第30分会：低维碳材料[C].中国化学会:,2014:1.
[33]乌兰.运用词汇教学策略提高高中学生英语词汇学习能力的研究[D].内蒙古师范大学,学科教学（专业学位）,2012,硕士.
[34]蒋正威,陈枫,孙维真,林荣东.发电市场输电阻塞管理算法[J].电力系统自动化,2006,05:33-36.
[35]余钦.中英基本医疗保障体系比较研究[D].上海工程技术大学,社会保障,2010,硕士.
[36]白艳芳.春秋晋国郤氏研究[D].山西师范大学,专门史,2013,硕士.
[37]杨飞.基于建构主义的高中英语词汇教学研究[D].河北师范大学,英语,2014,硕士.
[38]陈曦.基于压电驱动的振动网孔式雾化器的设计[D].苏州大学,机械电子工程,2013,硕士.
[39]杜玉娟.毛泽东统战理论及其中国传统文化特色研究[D].湖南科技大学,马克思主义中国化研究,2013,硕士.
[40]席艳丽.呼和浩特市《新标准英语》初中教材使用情况研究[D].内蒙古师范大学,课程与教学论,2012,硕士.
[41]王玲.“微暗的火”照亮晶莹之地[D].四川外国语大学,英语语言文学,2014,硕士.
[42]崔营.篆刻艺术对当代平面设计的启迪[D].湖南师范大学,设计艺术学,2013,硕士.
[43]王娜.麻省理工学院苏珊校长的办学理念与治校实践研究[D].沈阳师范大学,比较教育学,2014,硕士.
[44]孙振.基于能量平衡的钢筋混凝土框架结构抗震性能研究[D].山东建筑大学,结构工程,2013,硕士.
[45]魏长江.声波测井误差校正方法[J].石油地球物理勘探,1991,02:158-168+266.
[46]胡加林.袋装砂井处理软粘土路堤地基沉降与稳定性研究[D].浙江大学,建筑与土木工程,2004,硕士.
[47]郑晓琳.中医散文英译实践报告[D].上海师范大学,英语笔译（专业学位）,2013,硕士.
[48]王晓永.黑龙江省依兰矿区煤层气资源特征研究[D].吉林大学,地质工程,2012,硕士.
[49]刘淇.温泉疗养场所景观规划设计研究[D].西安建筑科技大学,设计艺术学,2013,硕士.
[50]方源.罪刑法定原则视角下的作为义务来源研究[D].吉林大学,刑法学,2013,硕士.