G蛋白偶联甲酰基肽受体在抗细菌感染和恶性肿瘤宿主防御中的作用

【摘要】细菌感染和恶性肿瘤与以白细胞浸润为特征的宿主保护性炎症反应，即宿主防御密切相关。炎性细胞的浸润受G蛋白偶联受体（Gprotein-coupledreceptors,GPCRs），包括甲酰基肽受体（Formylpeptidereceptors,FPRs）和趋化因子类GPCRs介导。FPRs（小鼠FPRs称为Fprs）具有病原模式识别受体（pathogenpatternrecognizingreceptor,PRR）特性，能够识别多种病原和宿主来源的趋化因子，而趋化因子类GPCRs通过感受多种内源性趋化因子而介导白细胞浸润。活化GPCRs能够触发一系列信号放大效应并最终促使中性粒细胞迁移，增强其对病原体和损伤组织的吞噬作用，同时能够增加杀菌性活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）的产生和基因转录。本课题通过系列实验证实Fprs（包括Fpr1和Fpr2）能够与Listeria菌释放的趋化性成分结合而介导中性粒细胞在Listeria感染的小鼠肝内快速聚集，从而对宿主抗Listeria感染的防御反应起到决定性作用。另外，Fpr2具有维持肿瘤相关巨噬细胞向具有抗肿瘤效应的M1方向分化的作用而利于机体免疫系统限制肿瘤发展。第一部分：FPRs在抗细菌感染宿主防御中的作用。材料与方法1.建立系统性Listeria感染模型。野生型（wildtype,WT）和Fpr基因敲除（knockout,KO；包括Fpr1-/-,Fpr2-/-和Fpr1/2-/-）小鼠分别尾静脉注射对数分裂期Listeria细菌建立系统性感染模型，观察WT和KO小鼠死亡率；检测小鼠肝脏内细菌数量、病灶数量和大小；确定病灶区中性粒细胞分布规律。2.肝内趋化因子检测。在不同时间点，ELISA检测小鼠肝脏内趋化因子CXCL1和CXCL2表达。3.趋化实验。使用合成Listeria肽（fMIVIL）和Listeria细菌裂解液检测其对HEK293细胞（humanembryonickidney293cells）和转染了Fpr1或Fpr2的HEK293细胞（HEK293/Fpr1和HEK293/Fpr2）细胞的趋化能力，证实Listeria含有FPR激动性配体（agonist）；使用WT和FprKO（包括Fpr1-/-,Fpr2-/-,Fpr1/2-/-）小鼠中性粒细胞证实Listeria所致的中性粒细胞趋化由FPRs介导。4.中性粒细胞对Listeria的吞噬和杀伤能力。中性粒细胞和热灭活Listeria共培养（1:100）后流式细胞术和免疫荧光检测中性粒细胞对Listeria的吞噬能力；中性粒细胞和Listeria活菌共培养（1:100）后接种于琼脂糖平板（Agarplate）计数细菌菌落形成单位（colonyformingunit,CFU）；检测中性粒细胞对H2O2（hydrogensuperoxide，过氧化氢）的表达能力。5.Listeria对中性粒细胞内信号分子磷酸化的影响。Listeria裂解液刺激中性粒细胞后裂解细胞提取总蛋白，检测细胞外信号调节激酶（extracellularsignal-regulatedkinase,Erk1/2）磷酸化水平。6.骨髓移植和骨髓细胞竞争性重分布。使用致死剂量放射性铯照射Fpr2-/-和Fpr1/2-/-小鼠并移植WT小鼠骨髓细胞，6周后建立感染模型，观察嵌合体小鼠（chimera）死亡率；使用不同荧光染料预标记WT和Fpr1/2-/-小鼠骨髓细胞，并等量注射入Fpr1/2-/-小鼠尾静脉，建立感染模型，观察WT和Fpr1/2-/-小鼠骨髓细胞在感染区的数量。结果1.Fpr基因敲除导致小鼠抗Listeria感染的宿主防御障碍。成功建立Listeria系统性感染模型，WT小鼠半数致死量为2×104个细菌，亚致死量为1×104个细菌。和WT小鼠相比（死亡率50%），Fpr1-/-和Fpr2-/-小鼠死亡率显著增高（10天内死亡率分别为100%和90%）；而Fpr1/2-/-小鼠在3天内死亡率达到100%。Listeria感染的Fpr1-/-、Fpr2-/-和Fpr1/2-/-小鼠肝内CFUs均显著增加（较WT小鼠分别增高50、40和80倍）。Fpr1-/-、Fpr2-/-和Fpr1/2-/-小鼠肝内脓肿数量增加、直径变大，而中性粒细胞浸润减少。2.Fprs介导感染小鼠肝内中性粒细胞快速聚集。在WT小鼠，肝内中性粒细胞在感染后30min内即快速增加并于2h内达到高峰；在Fpr基因敲除小鼠肝内中性粒细胞趋化延迟，峰值数量显著降低。骨髓细胞竞争性重分布显示感染区WT小鼠骨髓细胞显著多于Fpr1/2-/-小鼠骨髓细胞；移植WT小鼠骨髓细胞后能够显著降低Listeria感染的Fpr2-/-和Fpr1/2-/-小鼠死亡率。3.肝内趋化因子表达晚于早期中性粒细胞趋化聚集。肝内CXCL1和CXCL2表达上升分别开始于感染后8h和24h，显著晚于中性粒细胞趋化、聚集。4.Fpr1和Fpr2是Listeria趋化中性粒细胞的独有受体。Listeria裂解液能够趋化HEK293/Fpr1和HEK293/Fpr2细胞而不能趋化HEK293细胞，表明Listeria裂解液含有FPRagonist。Listeria裂解液对Fpr1-/-和Fpr2-/-小鼠中性粒细胞的趋化作用显著低于WT小鼠中性粒细胞，而对Fpr1/2-/-小鼠中性粒细胞完全不具有趋化作用，说明Listeria裂解液所导致的中性粒细胞趋化作用系通过Fpr1和Fpr2所实现，而Fpr1和Fpr2是介导该趋化反应的独有受体。5.Fpr1和Fpr2介导中性粒细胞H2O2分泌和杀菌作用。和WT小鼠中性粒细胞相比，Fpr基因敲除小鼠中性粒细胞对Listeria的吞噬作用未见改变，但是杀菌作用显著减弱。Fpr基因敲除小鼠中性粒细胞对H2O2的分泌能力显著降低；Listeria所致WT小鼠中性粒细胞对H2O2的分泌能够被Fpr特异性抑制性配体（antagonists）所抑制。6.上述作用主要由信号分子Erk1/2介导。Listeria裂解液能够显著上调中性粒细胞中Erk1/2的磷酸化，该作用能被Frpantagonists选择性阻断。第二部分：Fpr2在抗Lewis肺癌（Lewislungcarcinoma,LLC）宿主防御中的作用。材料与方法1.肿瘤模型。5×105LLC细胞接种于小鼠右侧胁腹部建立肿瘤模型，测量肿瘤体积和小鼠死亡率。在转移试验中，4×105LLC细胞经尾静脉注射，15天后计数肺部转移灶数量。2.免疫荧光染色。肿瘤组织冰冻切片，anti-CD11b，anti-F4/80或anti-CD31标记，免疫荧光和FACS检测肿瘤内骨髓来源白细胞、巨噬细胞数量，免疫荧光检测血管生成情况。3.趋化实验。检测LLC上清液对WT,Fpr2-/-和Fpr转基因（transgenic,Tg）小鼠巨噬细胞的趋化能力，并使用Fpr2antagonist、CCL2中和性抗体、CCR2抗体及CCR4antagonist选择性抑制趋化反应，检测LLC上清液对巨噬细胞趋化的特异性。4.Westernblotting。骨髓来源巨噬细胞以LLC上清液，LPS+IFNγ或IL4+IL13刺激，提取蛋白检测Arg1表达和STAT1、STAT3及STAT6磷酸化水平。5.肿瘤组织浸润白细胞的检测。Percoll法纯化肿瘤组织内浸润白细胞。纯化的白细胞经FACS检测肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associatedmacrophages,TAMs）、CD45+CD11b+F4/80+CD206+和CD45+CD11b+F4/80+CD11c+细胞数量及比例。6.RT-qPCR（reversetranscriptionquantitativePCR，反转录定量PCR）。RT-qPCR检测Arg1,iNOSandTNFαmRNA表达。结果1.Fpr2基因敲除导致LLC肿瘤生长加速，荷瘤小鼠死亡率增加，肺部转移灶增多。2.Fpr2-/-小鼠LLC肿瘤内浸润白细胞（CD11b+）增加，巨噬细胞（F4/80+）增加，血管生成增多（CD31+细胞增多）。3.Fpr2基因敲除导致巨噬细胞对LLC上清液趋化反应增强，该反应能够被CCL2抗体完全阻断，而被CCR2中和性抗体部分抑制。4.Fpr2-/-小鼠巨噬细胞表达CCR4增加。FACS、RT-qPCR检测显示Fpr2-/-小鼠骨髓来源巨噬细胞和TAM表达CCR4蛋白和mRNA增加。5.Fpr2基因敲除导致LLC内巨噬细胞向M2转化。Fpr2-/-小鼠骨髓来源巨噬细胞和TAM表达M2标记物iNOS，TNFα和phospho-STAT1减少，而表达M2标记物Arg1,phospho-STAT3和phospho-STAT6增加。结论1.Fpr1和Fpr2介导Listeria系统性感染时小鼠肝内中性粒细胞快速趋化和聚集以及H2O2依赖性的杀菌作用，从而参与宿主对细菌感染的早期防御反应；2.Fpr1和Fpr2是介导Listeria所致中性粒细胞趋化的独有受体；3.Fpr2通过限制肿瘤相关巨噬细胞向M2转化而促进宿主抗肿瘤防御；4.Fprs通过直接感知细菌趋化分子而介导中性粒细胞向细菌感染部位聚集，同时Fpr2通过调控肿瘤相关巨噬细胞浸润和分化而参与宿主抗肿瘤防御。综上所述，本文通过小鼠Listeria菌系统性感染模型，发现Fpr1和Fpr2介导细菌感染性疾病中中性粒细胞的早期、快速趋化和聚集，并通过调节H2O2的释放而参与中性粒细胞的杀菌作用，证实Fprs在感染性疾病中以早期中性粒细胞趋化聚集为主的宿主保护性免疫反应中起到重要作用；使用小鼠LLC模型，证实FPR2（Fpr2）能够限制肿瘤相关巨噬细胞向M2转化而促进宿主抗肿瘤防御。本研究为感染性疾病和肿瘤治疗提供了良好的理论基础和潜在的治疗靶点。
【作者】刘明永；
【导师】王爱民；
【作者基本信息】第三军医大学，外科学，2013，博士
【关键词】感染；甲酰基肽受体；趋化；活性氧；宿主防御；Lewis肺癌；巨噬细胞；极性；

【参考文献】
[1]邵启超.中国静脉产业园区发展模式研究[D].清华大学,环境工程（专业学位）,2012,硕士.
[2]李君.台湾电视商业新闻叙事模式研究[D].华中科技大学,广播电视传播学,2013,硕士.
[3]王敦鼎.经理股票期权制度在我国国有企业的应用研究[D].武汉理工大学,产业经济学,2003,硕士.
[4]黄永振.Fe、Co、Mn过渡金属掺杂LiNbO_3薄膜铁电铁磁性能研究[D].天津理工大学,材料学,2013,硕士.
[5]焦虎.瘢痕疙瘩自身免疫疾病特征和多聚嘧啶序列结合蛋白为治疗靶点的研究[D].北京协和医学院,整形外科学,2014,博士.
[6]欧玲.海洋生态文化建设初探[D].国家海洋局第三海洋研究所,海洋生物学,2013,硕士.
[7]黄文芹.矫正西部资源型产业生态负外部性研究[D].贵州财经大学,产业经济学,2013,硕士.
[8]方玲玲.语块教学对减轻语言僵化的认知研究[J].外语界,2010,04:63-66.
[9]于洪,杨大春,吴中福.基于粗糙集理论的数据挖掘的应用[J].计算机与现代化,2001,04:45-48+53.
[10]史丽彬.N-硝基-N-取代苯基酰胺的合成、生物活性及3D-QSAR研究[D].华中农业大学,应用化学,2014,硕士.
[11]张丽芳.高职大学生国防意识研究[D].厦门大学,高等教育学,2014,硕士.
[12]杨玉凤,马丰.分析型客户关系管理中决策支持技术的实现[J].江苏商论,2004,01:56-57.
[13]聂求宝.数字式电力线载波机的FPGA设计与实现[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2012,硕士.
[14]马丹丹.企业漂绿行为曝光效应研究[D].厦门大学,人口、资源与环境经济学,2014,硕士.
[15]杨赫姣.哲学自我形象的批判史观[D].东北师范大学,外国哲学,2012,硕士.
[16]张欣.碳基材料表面复合涂层及性能研究[D].东北大学,材料学,2010,硕士.
[17]汤良勇.盘盖类零件图作业批改软件若干技术的研究[D].西北工业大学,机械设计及理论,2004,硕士.
[18]周暾.中国古典文学中的“以悲为美”及其生成[D].湖南师范大学,文艺学,2014,硕士.
[19]格日乐.民间信仰、民族认同及其社会性解释[D].内蒙古师范大学,社会学,2012,硕士.
[20]周惠丽.一种新型抗肿瘤药物Copen的体内外药效及药代动力学研究[D].浙江大学,药理学,2012,硕士.
[21]孙风云.基于遗传算法的新型换流变压器损耗研究与优化设计[D].湖南大学,电气工程,2012,硕士.
[22]吉米·艾萨克松,张淑敏.有限差分近似法给出合成地震剖面[J].石油地球物理勘探,1977,03:36-43.
[23]张晓.光学成像条码定位理论研究及应用[D].南京理工大学,2006.
[24]丛炳龙,刘向东,陈振.一种改进的自适应滑模控制及其在航天器姿态控制中的应用[J].控制与决策,2012,10:1471-1476.
[25]王军.基于时频分布交叉项的水声信号特征提取[D].西北工业大学,水声工程,2004,硕士.
[26]孙利.基于CRM的XT人寿保险公司营销模型研究[D].西北大学,2003.
[27]王丽.短消息业务服务系统的研制[D].大连理工大学,计算机科学与技术,2003,硕士.
[28]朱丽芳.含铜镍浸出渣中铁、铜、镍的分离回收研究[D].西安建筑科技大学,冶金物理化学,2013,硕士.
[29]杨海生,王振华.三维地震常速叠前偏移[J].石油地球物理勘探,1998,04:467-476+572.
[30]肖立.拄拐配合中药治疗早中期股骨头坏死的临床研究[D].湖北中医药大学,中医骨伤科学（专业学位）,2013,硕士.
[31]曹春廷1,2,孙丛龙2,白卫滨2,*,孙建霞3,李国强2,欧仕益2,杨勇1,*.柘树果实的抗乳腺癌活性部分的提取、分离及结构鉴定[J].食品科学.
[32]万文莉.“很+有+N/NP”的多角度研究[D].华中师范大学,对外汉语教学,2013,硕士.
[33]郑高,戴玉松.人工智能方法在变压器故障诊断中的应用[J].四川工业学院学报,2004,S1:97-99+109.
[34]亢巨龙.郑州铁路集装箱中心站运输组织研究[D].西南交通大学,工商管理,2013,硕士.
[35]刘圣杰.浅埋隧道开挖岩体移动分析的模糊测度方法[D].河北大学,岩土工程,2014,硕士.
[36]任冬冬.文化差异对国际工程项目的财务风险影响研究[D].河北经贸大学,会计,2014,硕士.
[37]汤毛虎.基础设施投资能否拉动私人投资：来自中国制造业企业层面的发现[D].复旦大学,西方经济学,2012,硕士.
[38]林放.银行安防综合动态监控系统的研究与设计[D].北京邮电大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[39]王雄志,李方祥.客户关系管理的内容、程序与方法[J].江苏商论,2003,09:123-124.
[40]卢涛.农杆菌介导大豆胚尖转化体系的优化及Sporamin和Chitinase KDEL转化后代分析[D].浙江大学,作物学,2012,硕士.
[41]杨泽民,陈莉,范全润.加权关联规则的并行挖掘算法[J].计算机工程与应用,2003,08:192-193.
[42]朱科艺.改进Pushover法在鄂东长江大桥地震响应分析中的应用[D].西南交通大学,桥梁与隧道工程,2014,硕士.
[43]谢占安,周锦明.提高隐蔽油气藏勘探能力的新思路[J].石油地球物理勘探,2005,05:137-144+21-22.
[44]李健.具供氢体与催化中心双重结构的催化降粘剂及其降粘机理[D].中国地质大学,油气田开发工程,2014,博士.
[45]宿晓玮.基于像元分解的标志点亚像素定位研究[D].中国矿业大学,摄影测量与遥感,2014,硕士.
[46]宋耀东.地理国情监测技术与数据源分析研究[D].西安科技大学,测绘工程,2014,硕士.
[47]代嘉.后外侧入路锁定加压钢板治疗股骨远端骨折的临床研究[D].河北医科大学,外科学（专业学位）,2013,硕士.
[48]黄纳伯.脐周八穴透刺治疗脾虚湿阻型单纯性肥胖症的临床研究[D].福建中医药大学,针灸推拿学,2013,硕士.
[49]李磊陈健.让决策更科学[N].计算机世界,2001-04-09B12.
[50]蔡真.砂卵石地层不同盾构机开挖引起地表沉降特征及控制研究[D].西南交通大学,建筑与土木工程,2013,硕士.