针刺对抑郁大鼠星形胶质细胞谷氨酸功能影响的研究

【摘要】目的：本实验通过针刺改善慢性温和应激(chronicunpredictablemildstressCUMS)致抑郁模型大鼠和通过星形胶质细胞谷氨酸转运体拮抗剂致抑郁障碍大鼠星形胶质细胞谷氨酸的影响两个实验,来探讨针刺对抑郁大鼠星形胶质细胞谷氨酸功能的影响。该研究有别于以往针刺抗抑郁研究大多局限在信号转导通路这一传统的研究思路,是针刺抗抑郁机理研究的热点新领域。实验一针刺对CUMS致抑郁模型大鼠星形胶质细胞谷氨酸功能影响的研究方法：将9-10周龄体重250-300g的成年雄性SD大鼠56只,随机分为4组：空白组(n=11)、对照组(n=15)、针刺组(n=15)和药物组(n=15)；其中空白组大鼠不予任何处理,其余三组采用慢性不可预见性温和刺激联合孤养建立抑郁大鼠模型。对照组,造模成功后不予任何处理。针刺组,于造模成功后第二天开始进行针刺四关穴(合谷、太冲)治疗。治疗第1周每日1次,治疗第2周开始隔日1次,共治疗5周。药物组,于造模成功后第二天开始给予利鲁唑灌胃治疗,每24小时1次(4mg/kg),连续治疗5周。评价指标采用大鼠体质量和大鼠行为学指标。在造模前以及造模和治疗的第7、14、21、28、35天进行体质量测量、糖水偏好实验、50g进食量作为检验造模和治疗成功与否的重要指标。运用透射电镜、免疫组化技术、Western-Blot、RT-PCR技术四组检测指标观察各组大鼠海马和前额皮质星形胶质细胞结构和形态,谷氨酰胺合成酶(GS)、前额皮质及海马星形角质细胞高亲和性兴奋性氨基酸转运体(EAAT1、EAAT2)蛋白和基因表达的变化。采用SPSS20.0统计软件对实验数据进行统计分析,实验计量资料若服从正太分布,结果以均数±标准差(x±s),各组间差异及比较采用单因素方差分析(One-ANOVA)最小显著差法(LSD),以p<0.05为有统计学意义。组间比较采用方差分析,不服从正态分布或方差不齐,采用非参数检验；多个不同时点比较采用重复测量方差分析,不满足协方差矩阵或球形检验采用矫正检验(Greenhouse-Geisser)方法及两两比较,或者采用多元方差分析,检验水平α=0.05。结果：1.针刺对CUMS致抑郁模型大鼠行为学的影响通过体质量测量、糖水偏好实验、50g进食量实验,证明慢性应激性温和刺激造模后,造模各组大鼠各项指标下降,出现抑郁症状,对照组与空白组比较有统计学意义,各造模组大鼠组间比较差异无统计学意义。在5周治疗完成后,对照组各项指标上升,抑郁症状好转,与空白组比较差异有统计学意义；与对照组比较,针刺组和药物组各项指标上升,差异有统计学意义；针刺组与药物组比较,差异无统计学意义。2.透射电镜下观察针刺对CUMS致抑郁模型大鼠星形胶质细胞结构和形态的影响抑郁造模后,对照组、针刺组和药物组大鼠海马AST超微结构损伤,主要表现为胞质中粗面内质网明显扩张和线粒体的嵴疏松变,细胞核固缩。海马(CA1区-CA3区)出现锥体细胞变性,数目减少,细胞质中的微丝、微管明显减少,线粒体致密及空泡化情况,DG区部分颗粒细胞胞浆空泡化直至细胞水肿或致密样改变,出现坏死和凋亡前期的变化。前额皮质出现胞质中粗面内质网明显扩张和线粒体的嵴疏松变,细胞核固缩,微丝、微管明显减少,线粒体致密及空泡化情况。空白组大鼠海马和前额皮质没有出现明显的超微结构损伤。在5周治疗完成后,针刺组,海马(CA1区-CA3区)锥体细胞均恢复正常,数目增多,微丝、微管增多,线粒体致密及空泡化情况有所改善,星形胶质细胞核固缩部分恢复；DG区部分颗粒细胞、星形胶质细胞恢复正常。前额皮质颗粒细胞胞浆空泡化直至细胞水肿、致密样改变情况恢复,星形胶质细胞形态逐渐恢复。药物组,海马(CA1区-CA3区)锥体细胞均恢复正常,星形胶质细胞核固缩情况未见明显好转；DG区颗粒细胞恢复正常,星形胶质细胞恢复不明显。前额皮质胞质中粗面内质网扩张情况好转,线粒体的变致密,细胞核恢复,微丝、微管开始增多,线粒体致密及空泡化情况改善。针刺组和药物组疗效相当,和空白组比较没有显著差异,和对照组比较有显著差异。3.免疫组化技术观察针刺对CUMS致抑郁模型大鼠GS、EAAT1、EAAT2阳性细胞的形态和数目在5周治疗完成后,针刺组和药物组海马损伤区域GS、EAAT1阳性细胞在CUMS致损伤后各时相点损伤区周围皮质染色较深状况有恢复,有大量血管增生情况改善,CA1、CA3、DG区可见到较少的GS、EAAT1阳性细胞,胞体小呈空泡状、淡染、无突起,或有短小突起,也可见到少量胞体较大、染色较深、突起较长的GS、EAAT1阳性细胞,阳性细胞数目减少。针刺组和药物组前额皮质损伤区域GS、EAAT2阳性细胞在EAAT2拮抗剂损伤后周围皮质可见较少的胞体轮廓清晰、边缘呈深橄榄色、中心淡染、突起明显的GS、EAAT2阳性细胞,且集中分布于损伤区周围,阳性细胞数目减少。治疗恢复后和空白组相比较没有显著差异,和对照组有显著差异。阳性细胞数量与对照组和空白组相比明显减少,伤后各时相点数量无明显变化。二者比较有统计学差异。4.Westernblot技术观察针刺对CUMS致抑郁模型大鼠星形胶质细胞转运体蛋白表达的影响本实验采用WesternBlot技术检测大鼠海马GS、EAAT1蛋白的表达量,检测大鼠前额皮质GS、EAAT2蛋白的表达量,结果显示造模后抑郁大鼠海马GS、EAAT1蛋白含量显著减少,前额皮质GS、EAAT2蛋白含量显著减少,与空白组比较差异有统计学意义,与对照组比较差异没有统计学意义。在5周治疗完成后,大鼠海马GS、EAAT1蛋白含量与空白组比较差异无统计学意义,大鼠前额皮质GS、EAAT2蛋白含量与空白组比较差异无统计学意义,与对照组比较差异有统计学意义。且二者比较,差异无统计学意义,疗效相当。5.RT-PCR技术观察针刺对CUMS致抑郁模型大鼠星形胶质细胞转运体基因表达的影响本实验采用RT-PCR技术检测大鼠GS、EAAT1、EAAT2的mRNA表达量,结果显示造模后抑郁大鼠海马GSmRNA、EAAT1mRNA,前额皮质GSmRNA、EAAT2mRNA表达量下降,提示GS、EAAT1、EAAT2蛋白复制减少。本结果与慢性不可预见温和刺激后,海马GSmRNA、EAAT1mRNA和前额皮质GSmRNA、EAAT2mRNA蛋白含量减少的结果相符合。与空白组比较差异有统计学意义,与对照组基因表达量相似,差异没有统计学意义。经针刺或利鲁唑灌胃干预后,大鼠海马GSmRNA、EAAT1mRNA,前额皮质GSmRNA、EAAT2mRNA表达量上升,与空白组比较差异均无统计学意义,且二者疗效相当,与对照组比较差异有统计学意义。实验二针刺对EAAT1、EAAT2拮抗剂致抑郁模型大鼠星形胶质细胞谷氨酸功能影响的研究方法：将7-9周龄体重270-290g成年雄性SD大鼠75只,随机分为：空白组(n=5)。EAAT1组(n=30只),其中EAAT1对照组(n=10)、EAAT1针刺组(n=10)、EAAT1药物组(n=10)。EAAT2组(n=30只),其中EAAT2对照组(n=10)、EAAT2针刺组(n=10)、EAAT2药物组(n=10)。空白组大鼠正常饲养,不予任何处理。EAAT1于侧脑室埋管术后第8天侧脑室注射星形胶质细胞转运体EAAT1拮抗剂(DL-threo-β-benzyloxyaspartate,TBOA)(100ug/ul,lul),注射速率控制在0.25ul/min,注射频次为,前1周每隔两天注射1次共3次,此后每隔一天对大鼠以相同浓度和速率进行侧脑室注射一次共3周,造模周期为4周,共进行药物注射15次；EAAT2于大鼠大脑前额皮质埋管术后第8天前额皮质注射星形胶质细胞转运体EAAT2拮抗剂(dihydrokainicacid,DHK),(100ug/ul,lul),注射速率、剂量、频次、周期均同侧脑室注射EAATl组。EAAT1对照组和EAAT2对照组造模成功后不予任何处理。EAAT1和EAAT2针刺组大鼠,于造模结束后第二天开始进行针刺四关穴(合谷、太冲)治疗,具体操作方法和治疗周期同“实验一”。EAAT1和EAAT2药物组大鼠,于造模结束后第二天开始进行利鲁唑灌胃治疗,具体操作方法和治疗周期同“实验一”。评价指标为大鼠的行为学指标。在造模前以及造模的第7、14、21、28天进行体重测量、糖水偏好实验、敞箱试验作为检验造模成功与否的重要指标；在治疗后第7、14、21天进行上述指标检测,对针刺和药物的疗效进行评价。针刺和药物治疗结束后,运用光镜、透射电镜、Western-Blot、RT-PCR四组检测技术指标观察大鼠海马和前额皮质星形胶质细胞结构和形态,谷氨酰胺合成酶(GS)、前额皮质及海马星形角质细胞高亲和性兴奋性氨基酸转运体(EAAT1、EAAT2)蛋白和基因表达的变化。统计方法同实验一。结果：1.针刺对注射EAAT1、EAAT2拮抗剂致抑郁模型大鼠行为学的影响通过体质量测量、糖水偏好实验、敞箱实验,证明侧脑室注射EAAT1拮抗剂、前额皮质注射EAAT2拮抗剂造模后,对照组与空白组比较有统计学意义,各造模组大鼠组间比较差异无统计学意义。治疗3周结束后,对照组各项指标上升,与空白组比较差异有统计学意义；与对照组比较,针刺组和药物组差异有统计学意义；针刺组与药物组比较,差异无统计学意义；针刺组和药物组与空白组比较,差异无统计学意义。表明针刺对注射EAAT1、EAAT2拮抗剂致抑郁模型大鼠行为学有着显著影响。2.光镜下观察针刺对注射EAAT1、EAAT2拮抗剂致抑郁模型大鼠星形胶质细胞形态和结构的影响在接受5周侧脑室和前额皮质注射后,造模大鼠海马各区(CA1、CA3、DG区)星形胶质细胞数目均明显减少,前额皮质星形胶质细胞数目均明显减少,与空白组比较,差异有统计学意义,与对照组比较,差异无统计学意义；治疗3周后,药物组大鼠海马CA1、CA3、DG区星形胶质细胞数目明显增多,前额皮质星形胶质细胞数目均明显增多,与对照组比较,差异有统计学意义,与空白组比较,差异无统计学意义；针刺组大鼠海马CA1区、CA3区、DG区星形胶质细胞数目增多,前额皮质星形胶质细胞数目均明显增多,与对照组比较,差异有统计学意义,与空白组和药物组比较差异无统计学意义；针刺组前额皮质星形胶质细胞数目有少量上升,与药物组和空白组比较差异无统计学意义,与对照组比较差异有统计学意义。3.透射电镜下观察针刺对注射EAAT1、EAAT2拮抗剂致抑郁模型大鼠星形胶质细胞结构和功能的影响抑郁造模后,各组大鼠海马AST超微结构损伤,主要表现为胞质中粗面内质网明显扩张和线粒体的嵴疏松变,细胞核固缩。海马的CA1区、CA3区出现锥体细胞变性,数目减少,细胞质中的微丝、微管明显减少,线粒体致密及空泡化情况,DG区部分颗粒细胞胞浆空泡化直至细胞水肿或致密样改变,出现坏死和凋亡前期的变化。前额皮质出现胞质中粗面内质网明显扩张和线粒体的嵴疏松变,细胞核固缩,微丝、微管明显减少,线粒体致密及空泡化情况。与空白组比较,有显著差异。与对照组比较,没有显著差异。治疗3周后,针刺组,CA1区、CA3区锥体细胞均恢复正常,数目增多,微丝、微管增多,线粒体致密及空泡化情况有所改善,星形胶质细胞核固缩部分恢复；DG区部分颗粒细胞、星形胶质细胞恢复正常。前额皮质颗粒细胞胞浆空泡化直至细胞水肿、致密样改变情况恢复,星形胶质细胞形态逐渐恢复。药物组,CA1区、CA3区锥体细胞均恢复正常,星形胶质细胞核固缩情况未见明显好转；DG区颗粒细胞恢复正常,星形胶质细胞恢复不明显。前额皮质胞质中粗面内质网扩张情况好转,线粒体的变致密,细胞核恢复,微丝、微管开始增多,线粒体致密及空泡化情况改善。和空白组比较,没有显著差异。和对照组比较,有显著差异。针刺组和药物组疗效相当。4.Westernblot技术观察针刺对注射EAAT1、EAAT2拮抗剂致抑郁模型大鼠星形胶质细胞转运体蛋白表达的影响拮抗剂抑郁造模后,抑郁大鼠海马GS、EAAT1蛋白含量显著减少,前额皮质GS、EAAT2蛋白含量显著减少,与空白组比较差异有统计学意义,与对照组比较差异无统计学意义,提示抑郁大鼠海马以及前额皮质AST功能或结构受到影响,导致其GS、EAAT1、EAAT2蛋白合成水平下降。针刺和利鲁唑灌胃干预后,大鼠海马GS、EAAT1蛋白含量增多,与空白组比较差异无统计学意义,与对照组比较差异有统计学意义,大鼠前额皮质GS、EAAT2蛋白含量增多,与空白组比较差异无统计学意义,与对照组比较差异有统计学意义。且二者比较,差异无统计学意义,且二者的作用相似。6.RT-PCR技术观察针刺对注射EAAT1、EAAT2拮抗剂致抑郁模型大鼠星形胶质细胞转运体基因表达的影响本实验采用RT-PCR技术检测大鼠海马和前额皮质GS、EAAT1、EAAT2的mRNA表达量,结果显示造模组侧脑室和前额皮质造模后抑郁大鼠海马GSmRNA、EAAT1mRNA,前额皮质GSmRNA、EAAT2mRNA表达量下降,提示GS、EAAT1、EAAT2蛋白复制显著减少,与空白组比较差异有统计学意义,与对照组比较差异无统计学意义。经针刺或利鲁唑灌胃干预后,大鼠海马GSmRNA、EAAT1mRNA,前额皮质GSmRNA、EAAT2mRNA表达量上升,与空白组比较差异无统计学意义,与对照组比较差异有统计学意义,且二者的作用相似。结论：本研究通过上述两个实验相互佐证证明：①针刺对慢性不可预见性温和刺激联合孤养造模导致的抑郁大鼠海马星形胶质细胞结构的损伤和功能的改变有很好的调节作用；②针刺对侧脑室注射EAAT1、前额皮质注射EAAT2拮抗剂造模导致的造模抑郁大鼠海马、前额皮质星形胶质细胞结构的损伤和功能的改变有很好的调节作用；③两个实验中,针刺的抗抑郁机制作用与利鲁唑类同。实验结果表明,针刺对星形胶质细胞谷氨酸功能的调节作用可能是其发挥抗抑郁的重要机制之一。
【作者】肖瑶；
【导师】符文彬；
【作者基本信息】广州中医药大学，针灸推拿学，2014，博士
【关键词】针刺；抑郁症；谷氨酸转运体；拮抗剂；星形胶质细胞；机理研究；

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