降糖三黄片对糖尿病大鼠骨骼肌GLUT4的转位通路研究及循证研究

【摘要】文献研究：近年,全球糖尿病发病率呈逐年增长趋势,严重威胁着人类的健康。而目前糖尿病的发病机制尚不完全清楚,胰岛素抵抗作为其重要的发病机制,它的发生又以受体后胰岛素信号转导通路异常多见。改善胰岛素信号通路的异常,势必改善胰岛素抵抗,达到糖尿病的治疗目的。中医药作为防治糖尿病及其并发症的措施之一,有其独特优势。中医学对糖尿病即消渴病的认识源远流长,早在《黄帝内经》就有对消渴病的记载,历代医家、后世学者在治疗消渴病中也积累了丰富的诊疗经验。总结古今中医药辨证治疗消渴病的文献,消渴病的病机以“虚”、“热”、“瘀”多见,而“虚”又以气虚、阴虚为主,治疗时容益气养阴、泻热通瘀于一方,能有效的诊治消渴病。降糖三黄片系我校熊曼琪教授经验总结,组方时正是以气阴两虚、热瘀互结为糖尿病的辨证要点,运用、研究已二十余年,疗效确切。现通过实验再次观察其对糖尿病的治疗作用,以增加其循证治疗证据的强度。实验研究：目的：利用糖尿病模型大鼠观察降糖三黄片对骨骼肌GLUT4及其影响GLUT4转位的PI3-k/Akt通路、CAP通路中的关键信号蛋白PI3-kp85α、Akt1、CAP的表达的影响,观察其对骨骼肌中己糖胺通路的关键限速酶GFAT表达的影响,进而阐述降糖三黄片增强糖尿病骨骼肌功能的机理,为其增强胰岛素敏感性提供新的解释。方法：将70只SPF级SD大鼠适应性喂养1周后,按体重随机分成正常组8只和造模组62只,雌雄分笼饲养。从造模组中随机选取20只大鼠进行造模预实验,造模前禁食12h,按35mg/kg剂量的STZ一次性腹腔注射造模,正常组注射同体积的枸橼酸盐缓冲液。注射72h后测定大鼠空腹血糖,以空腹血糖≥16.7mmol/l作为2型糖尿病模型,观察大鼠血糖值及死亡情况,隔日后对剩余的造模组大鼠以30mg/kg剂量的STZ一次性腹腔注射造模。成模大鼠按空腹血糖值随机分成模型组11只、降糖三黄片组12只、益气养阴组11只。造模前后均喂食清洁级大鼠普通饲料。正常组、模型组予以灌服等量的饮用水；降糖三黄片组按0.675g/kg·d给药；益气养阴组按6.48g/kg·d给药,连续8周。实验期间大鼠自由进食、饮水。治疗8周末处死,共30只大鼠完成实验,正常组8只,模型组7只,降糖三黄片组8只,益气养阴组7只。实验期间分别在STZ注射72h后、治疗前、治疗4周以及治疗8周末检测FBG；比较造模前、治疗4周、8周各组大鼠体重；治疗8周后测FINS、HbAlc、血脂(TC、TG、LDL、HDL),留取大鼠股四头肌标本,用RT-PCR法测定GLUT4、CAP、GFAT指标；用Westernblot技术测定GLUT4、PI3-kp85α、Akt1指标。研究结果：治疗4周,与模型组比较,降糖三黄片组能减轻体重的下降,并有统计学意义(P<0.05),而益气养阴组不能(P>0.05)；降糖三黄片组、益气养阴组较模型组均能降低FBG,并有统计学意义(P<0.01)；与益气养阴组比较,降糖三黄片组不能减轻体重的下降、不能降低FBG(P>0.05)。治疗8周,与模型组比较,降糖三黄片组、益气养阴组均能增加骨骼肌P13-kp85α蛋白水平,增加CAPmRNA的表达,升高FINS水平,并降低FBG、HbAlc,减轻体重的下降,并有统计学意义(P<0.05)；降糖三黄片组能增加骨骼肌GLUT4mRNA及GFATmRNA的表达,增加GLUT4、Aktl蛋白水平,能降低TC、TG、LDL,升高HDL,增加ISI并有统计学意义(P<0.05),而益气养阴组不能(P>0.05)。与益气养阴组比较,降糖三黄片组不能减轻体重下降、不增加ISI(P>0.05),但能增加骨骼肌CAP、GLUT4mRNA及GFATmRNA的表达,增加GLUT4、PI3-kp85α、Akt1蛋白水平,降低TC、TG、LDL,升高HDL,升高FINS,降低FBG、HbAlc,并有统计学意义(P<0.05)。与自身治疗4周比较,降糖三黄片组能持续降糖,并有统计学意义(P<0.05),而益气养阴组不能(P>0.05)。结论：降糖三黄片能抑制己糖胺通路的关键限速酶GFATmRNA的表达,增加糖尿病大鼠FINS水平,进而增加骨骼肌CAPmRNA、PI3-kp85α蛋白、Akt1蛋白的表达,增加骨骼肌GLUT4mRNA、GLUT4蛋白的表达,从而降低FBG、HbAlc水平、缓解体重的下降；增加了骨骼肌的胰岛素信号传导相关基因、蛋白的表达,又进一步增强了胰岛素的敏感性,增强了葡萄糖转运,改善了糖代谢,纠正了脂质代谢紊乱；脂质代谢紊乱的纠正,又进而保护了残余胰岛β细胞功能、抑制了糖基化反应、改善了胰岛素抵抗,从而又有效地控制了血糖；这些使得降糖三黄片对糖尿病的多靶点作用产生协同效应,达到了最佳的治疗效果。降糖三黄片也优于益气养阴中药,能持久的发挥多靶点降糖作用。循证研究：目的：利用循证医学系统评价的方法,分析益气养阴、泻热通瘀法的加味桃核承气汤及降糖三黄片对糖尿病模型动物的防治作用。方法：计算机检索文献数据库,手工检索广州中医药大学图书馆学位论文数据库,由两名研究者按纳入与排除标准独立选择实验、提取数据、评价质量并交叉核对,运用RevMan5.1软件、Stata11.0软件对数据进行分析,对不能进行合并分析的数据,则进行描述性的定性分析。研究结果：共纳入15个实验研究,参照ARRIVE指南,各实验报道较全面。与正常组比较,模型组各项检测指标均有统计学意义(P<0.05),各研究模型一定程度上反应了糖尿病及其并发症的特征性变化。与模型组比较,加味桃核承气汤组能降低FSG水平(P<0.01),加味桃核承气汤组、降糖三黄片组均能降低糖尿病大鼠FBG、增加ISI,降低TC,延缓体重的下降(P<0.01)；加味桃核承气汤组,降糖三黄片组均不能降低HbAlc及LDL、不能增加HDL水平(P>0.05)；亚组分析显示加味桃核承气汤组能减少大鼠的每日饮水量、每日进食量、每日排尿量(P<0.01),而降糖三黄片组不能(p>0.05)；降糖三黄片组能增加大鼠FINS、降低TG水平(P<0.01),而加味桃核承气汤组不能(P>0.05)。在保护糖尿病靶器官的研究中显示加味桃核承气汤组能保护血管、肾脏、心脏、胰腺；降糖三黄片组能保护肝脏、小肠,Meta分析亦显示降糖三黄片组不降低糖尿病大鼠BUN水平(p>0.05),但能降低肾脏TGF-β1的表达、降低肾重指数、Scr及24h尿蛋白水平(P<0.05),从而保护肾脏。敏感性分析显示造模方式、给药不同是造成实验间异质性的重要原因.其结果示加味桃核承气汤组、降糖三黄片组均较模型组能降低FBG、增加FINS水平(P<0.01),降糖三黄片组能减轻大鼠体重的下降(P<0.01)。累积Meta分析显示自1999年至今加味桃核承气汤组、降糖三黄片组均显示了良好的降糖效果,大样本的研究也使得结果更加可靠、稳定。发表性偏倚检验中漏斗图、Begg’s检验和Eegg’s检验均提示纳入的有关空腹血糖研究的13篇文献存在一定的发表性偏倚(P<0.01)。结论：益气养阴、泻热通瘀法的加味桃核承气汤、降糖三黄片能多靶点的增加胰岛素的敏感性、降低血糖、缓解症状等,能多部位、多途径的防治糖尿病的并发症。对纳入的15项研究中的13项研究行发表性偏倚检验无疑将增加偏倚风险,考虑到发表性偏倚在Meta分析中不可避免,此篇动物实验的系统评价仍不失为能为进一步开展指导糖尿病及其并发症的临床研究,获取高级别循证证据提供一些参考。
【作者】吴伟；
【导师】朱章志；
【作者基本信息】广州中医药大学，中医临床基础，2014，博士
【关键词】降糖三黄片；糖尿病；骨骼肌；动物实验；系统评价；

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