减味寿胎丸提取工艺及其有效成分的药动学和血清药理学研究

【摘要】目的：以减味寿胎丸总黄酮含量为指标,通过单因素考察和正交设计,优化减味寿胎丸总黄酮的提取工艺；利用UPLC-MS研究减味寿胎丸总黄酮中金丝桃苷和槲皮素在大鼠体内的药代动力学参数,根据药物达峰时间,制备含药血清；原代培养人早孕蜕膜细胞,建立米非司酮损伤人早孕蜕膜细胞模型,并以此为载体,观察含药血清对细胞凋亡模型的影响。方法：1.优化减味寿胎丸总黄酮的提取工艺：以芦丁为对照品,利用比色法测定寿胎丸提取液中的总黄酮含量,采用单因素考察及正交试验设计法优选减味寿胎丸中总黄酮的回流提取工艺参数。2.UPLC-MS同时测定减味寿胎丸中金丝桃苷和槲皮素：通过优化色谱条件和质谱条件,建立UPLC-MS方法,同时检测减味寿胎丸提取液中的金丝桃苷和槲皮素。3.大鼠血液中减味寿胎丸的金丝桃苷和槲皮素药代动力学研究：(1)优化液质联用条件,建立同时检测大鼠血浆中减味寿胎丸的金丝桃苷和槲皮素的UPLC-MS方法。(2)SD雌鼠随机分为3组,每组6只,分别灌予减味寿胎丸、金丝桃苷和槲皮素,灌药后分别在5min、10min、20min、30min,45min、60min、90min、120min、240min、360min从眼眶静脉丛采血0.5ml,分离得血浆,采用乙酸乙酯液-液提取方法进行样品预处理,己烯雌酚作为内标。应用优化好的UPLC-MS方法测定大鼠血浆中金丝桃苷和槲皮素的含量,获得药时曲线和药动参数。4.人早孕蜕膜细胞凋亡模型的建立：应用复合酶消化法分离人早孕蜕膜细胞,利用差时贴壁法纯化人早孕蜕膜细胞。施加不同浓度的米非司酮于人早孕蜕膜细胞,通过细胞抑制率、早期凋亡率、caspase-3基因表达3个指标评价人早孕蜕膜细胞凋亡的情况,确定适合造模的米非司酮浓度。5.减味寿胎丸及其有效成分含药血清对人早孕蜕膜细胞损伤模型的影响：SD雌鼠随机分为6组,每组5只,分别予地屈孕酮、减味寿胎丸、菟丝子、金丝桃苷、槲皮素、生理盐水灌胃,约在药物达峰时间用10%水合氯醛麻醉大鼠,腹主动脉采血,分离得到含药血清。选取纯度大于90%生长状态良好的人早孕蜕膜细胞,予造模浓度的米非司酮干预后,施加制备好的含药血清干预造模细胞,通过MTT法、流式细胞术、PCR和免疫印迹检测相关指标,以观察含药血清对细胞模型的影响。结果：1.减味寿胎丸总黄酮的测定方法简单可靠,标准曲线为：y=1.205x,r=0.9998,芦丁0.112～0.56mg/mL范围内线性良好。通过单因素考察和正交试验设计得出回流提取减味寿胎丸总黄酮的最佳条件为：乙醇浓度为60%,料液比为1：10,回流提取2次,每次提取时间为0.5h。2.建立了同时检测减味寿胎丸中的金丝桃苷和槲皮素的UPLC-MS方法,标准曲线r>0.999,在0.25ug/ml-4ug/ml范围,线性关系良好,精密度、回收率等均符合要求,测得减味寿胎丸提取液中的槲皮素和金丝桃苷分别为0.15mg/ml和1.98mg/ml.3.血浆中金丝桃苷和槲皮素分别在5-5000、1-1000ng/mL范围内线性关系良好(r2≥0.9954),最低定量限(LLOQ)≤5ng/mL.日内、日间精密度的相对标准偏差(RSD)均小于8.2%,相对误差(RE)为-5%～6%。平均提取回收率为71%～83%范围内,基质效应其均值处于94%～99%范围内。大鼠口服灌胃后金丝桃苷和槲皮素吸收快,Tmax均小于60min。从药-时曲线可见复方组中的Cmax较单体组的高,生物利用度较高。4.复合酶法分离得到人早孕蜕膜细胞,通过差时贴壁法纯化至第3代,荧光免疫法鉴定角蛋白7为阴性,波形蛋白为阳性,泌乳素为阳性,纯度大于90%；放射免疫法测定第1-10代细胞上清液均含有PRL,在第8代后细胞上清中PRL呈现递减趋势。在生长旺盛期,施加5个不同浓度的米非司酮,MTT法检测生长抑制率,24h半数抑制浓度为8×10-mol/l:随着米非司酮浓度的增加早期凋亡率、caspase-3基因表达均有增加。综合评价后,确定人早孕蜕膜细胞凋亡造模浓度为6×10-mol/l,药物作用时间为24h。5.各组血清药物干预人早孕蜕膜细胞凋亡模型后,与空白模型组比较,孕酮血清组、寿胎丸血清组、菟丝子血清组、金丝桃苷血清组和槲皮素血清组的生长抑制率、早期凋亡率、caspase一3凋亡基因表达均有所降低。结论：1.本研究优化确定了减味寿胎丸总黄酮回流提取工艺,具有工艺简单易行、稳定性与重复性好、省时节能等特点。2.建立了UPLC-MS同时测定减味寿胎丸提取液中金丝桃苷和槲皮素含量的方法。经过验证,精密度、回收率等均符合要求,是实现质量控制的保障。3.建立了检测大鼠血浆中金丝桃苷和槲皮素的UPLC-MS分析方法,该方法样品前处理过程简单,分析时间短,专属性、线性关系、精密度、准确度、回收率、基质效应等均符合要求,并成功地应用于其药代动力学研究。复方组生物利用增加,优于单体组,说明复方中药物间有协同作用,促进了有效成分金丝桃苷和槲皮素的吸收。4.原代培养人早孕蜕膜细胞,建立了米非司酮诱导人早孕蜕膜细胞凋亡的模型,以此为载体,研究了减味寿胎丸及其有效成含药血清对人早孕蜕膜细胞凋亡的影响。结果显示减味寿胎丸及有效成分可不同程度抑制人早孕蜕膜凋亡
【作者】刘秀明；
【导师】罗颂平；
【作者基本信息】广州中医药大学，中医学，2014，博士
【关键词】减味寿胎丸；蜕膜细胞；药代动力学；血清药理；金丝桃苷；槲皮素；

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