健脾活血祛湿方对肝硬化腹水大鼠肝AQP8、9和线粒体的影响

【摘要】研究目的：肝硬化腹水是许多肝脏疾病终末期(失代偿期)的常见并发症,一旦腹水形成,对人体健康影响极大,祖国医学中并无此病名记载,可将其归属于“鼓胀”、“积聚”、等范畴,对症支持治疗是临床主要治疗手段,但治疗效果一般。导师刘友章教授运用“肝病实脾”、“脾-线粒体相关”理论为指导,结合多年临床经验,自拟健脾活血祛湿方对本病进行治疗,方中药物多为岭南道地药材,极具特色,且通过大量实践,证实该方临床疗效显著。本课题主要通过动物实验进一步验证健脾活血祛湿方的疗效,并通过对肝AQP8、9,线粒体等指标的比较观察来更为深入的探究健脾活血祛湿方治疗肝硬化腹水的疗效机制,同时通过实验研究,为运用岭南道地药材在治疗本病中的应用提供更多的科学和实验依据。研究方法：本课题由文献及实验研究两部分组成。在第一部分文献研究中,我们先详细总结和整理了古代中医对肝及肝硬化腹水(鼓胀)的认识和研究,后又对肝硬化腹水发生机制、治疗概况及肝硬化腹水动物模型的研究进行了分析、整理。第二部分实验研究选用健康SPF级雄性Wistar大鼠90只,10只随机选取作为空白组(A组),剩余80只大鼠依据CCL4-酒精综合法进行肝硬化腹水造模。造模第1天,除了空白组,其余大鼠均以四氯化碳行腹部皮下注射,注射剂量以5ml/Kg体重折算。造模第2天开始,将按4：6比例配置的四氯化碳-橄榄油混合溶液用于大鼠腹部皮下注射,注射剂量以3mL/Kg体重折算,间隔3天注射一次。根据体重变化随时调整注射剂量,每周进行一次体重测量。而空白组大鼠则使用相同容量的橄榄油进行腹部皮下注射。实验过程中,将配置好的医用酒精溶液(用蒸馏水加75%医用酒精配置,浓度10%)作为造模大鼠的饮用水。大鼠进食不予控制,以普通饲料喂养。直至模型组大鼠肝硬化腹水形成。第8周后,造模大鼠还剩65只大鼠,根据成膜标准,对大鼠行诊断性穿刺确定50只伴有腹水,再将腹水大鼠随机分为五组(各组10只)进行灌胃治疗。空白组(A组)和模型组(B组)两组给予等容量的生理盐水灌胃,其余三组分别予健脾活血祛湿方灌胃,分别是健脾活血祛湿方高剂量组(C组),剂量按52g/kg折算、健脾活血祛湿方中剂量组(D组),剂量按26g/kg折算、健脾活血祛湿方低剂量组(E组),剂量按16.25g/kg折算,秋水仙碱组(F组)予秋水仙碱混悬液灌胃,剂量100ug/Kg。以上各组灌胃液体量为10ml/kg体重,其浓度及等效剂量按体重折。共灌胃4周,每日灌胃1次。整个实验过程中,观察记录大鼠活动情况、精神状态变化、摄食量的改变、体重变化,毛皮状况,大便情况等。各组分别于用药治疗4周,实验持续12周后,观察大鼠腹水消退程度,进行腹水量测定,抽取大鼠门静脉血以测定ALT、AST、ALB等相应肝功能指标,并按照需要进行取材。行肝组织AQP8、AQP9PCR定量、WesternBlotting检测、ICH检测、肝线粒体细胞色素C氧化酶活性、ATP含量、ATP酶活性测定,观察其表达变化,统计分析数据。研究结果：1.动物一般情况本实验造模大鼠死亡率为18.75%,腹水形成率为76.92%。造模大鼠出现烦躁不安、毛色渐杂乱而无泽,活动减少,饮食减少,体重减轻,大部分大鼠粪便软而臭。在开始治疗后,治疗组大鼠上述情况均有不同程度改善。2.大鼠腹水消退情况A组大鼠未出现腹水,B、F组大鼠腹水较多,腹水呈淡黄色；C、D、E组大鼠腹水量显著减少,腹水呈淡黄色,与B组比较,差异显著(P<0.01)。F组与B组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3.肝功能相应指标检测结果模型组大鼠ALT及AST显著增高,与空白组相比,差异显著(P<0.01)；同时模型组ALB降低,与空白组相比,差异显著(P<0.01)；健脾活血祛湿方干预后,各组大鼠ALT、AST均降低,且ALB增高,效应与秋水仙碱组相同；其干预程度与中药使用剂量相关,健脾活血祛湿方高剂量组干预效果最显著,与空白组相比差异无统计学意义(P>0.05),而健脾活血祛湿方中、低剂量组及秋水仙碱组各指标分别与空白组相比,差异显著(P<0.01)。4.健脾活血祛湿方对各组大鼠肝组织水通道蛋白8的影响模型组AQP8mRNA表达较空白组明显减少(P<0.01),健脾活血祛湿方高剂量组AQP8mRNA表达较模型组显著升高(P<0.01),秋水仙碱组与健脾活血祛湿方中、低剂量组AQP8mRNA表达与模型组差异有统计学意义(P<0.05)；免疫组化结果显示模型组AQP8少量表达,与空白组比较,AQP8蛋白表达量有显著差异(P<0.01),健脾活血祛湿方高剂量组与模型组比较,AQP9蛋白表达量显著增高(P<0.01)；WesternBlotting结果显示健脾活血祛湿方高剂量组表达较模型组明显升高(P<0.01),健脾活血祛湿方中剂量组AQP8表达较模型组略有升高,但差异无统计学意义(P>0.05),健脾活血祛湿方低剂量组AQP8表达低于模型组。秋水仙碱组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)可见,AQP8基因及蛋白表达升高程度与中药使用剂量有关。5.健脾活血祛湿方对各组大鼠肝组织水通道蛋白9的影响模型组AQP9mRNA表达较空白组明显减少(P<0.01),健脾活血祛湿方高、中剂量组AQP9mRNA表达较模型组明显升高(P<0.01),秋水仙碱组与低剂量组AQP9mRNA表达与模型组差异有统计学意义(P<0.05)；免疫组化结果显示模型组AQP9少量表达,与空白组比较,AQP9蛋白表达量有显著差异(P<0.01)；健脾活血祛湿方高剂量组与模型组与比较,AQP9蛋白表达量显著增高(P<0.01)；WesternBlotting结果显示模型组AQP9表达较空白组显著减少(P<0.01),健脾活血祛湿方高、中剂量组AQP9表达较模型组明显升高(P<0.01),健脾活血祛湿方低剂量组AQP9表达与模型组差异无统计学意义(P>0.05),秋水仙碱组与模型组AQP9表达比较有显著差异(P<0.01)。可见,AQP9基因及蛋白表达升高程度与中药使用剂量有关。6.健脾活血祛湿方对各组大鼠肝线粒体能量代谢的影响(1)肝线粒体细胞色素C氧化酶活性检测结果模型组肝线粒体细胞色素C氧化酶活性低于空白组,与空白组相比有显著差异(P<0.01),经过治疗后健脾活血祛湿方可使肝细胞线粒体细胞色素C氧化酶活性升高,其中升高程度与中药使用剂量有关,健脾活血祛湿方低剂量组与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)；健脾活血祛湿方中剂量组及高剂量组与模型组相比差异显著(P<0.01)；秋水仙碱组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(2)线粒体ATP含量检测结果模型组ATP含量明显低于空白组,与空白组相比有显著差异(P<0.01)。经过治疗后健脾活血祛湿方可使肝细胞线粒体ATP含量升高,其升高程度与中药使用剂量有关,健脾活血祛湿方低剂量组与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)；健脾活血祛湿方高、中剂量组与模型组相比有显著差异(P<0.01)；秋水仙碱组与模型组比较差异没有统计学意义(P>0.05)。(3)肝线粒体ATP酶活性检测模型组ATP酶活性明显低于空白组,与空白组相比有差异显著(P<0.01)。经过治疗后健脾活血祛湿方可使肝细胞线粒体ATP酶活性升高,其升高程度与中药使用剂量有关,健脾活血祛湿方低剂量组与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)；健脾活血祛湿方高、中剂量组与模型组相比差异显著(P<0.01)；秋水仙碱组与模型组比较差异没有统计学意义(P>0.05)。研究中发现秋水仙碱有改善肝线粒体细胞色素C氧化酶活性的作用(P<0.05),但对线粒体ATP酶活性表达和ATP生成没有作用(P>0.05)。说明其保肝作用可能是通过其他机制产生,不能证明是通过干预肝线粒体能量代谢而发挥作用的。研究结论：1.进过改良的四氯化碳-酒精综合法造肝硬化腹水大鼠模型,是目前较为理想的肝硬化腹水实验造模方法。2.健脾活血祛湿方对肝硬化腹水大鼠症状有明显改善作用、能使其摄食情况好转,体重逐渐上升,毛色渐润泽,活动增加。且能促进模型大鼠腹水消退,能显著减少模型大鼠的腹水量。3.健脾活血祛湿方能显著降低AST、ALT水平,升高ALB水平,起到保护肝功能的作用。4.健脾活血祛湿方可明显提高肝硬化腹水大鼠水通道蛋白AQP8基因及蛋白的表达。5.健脾活血祛湿方可明显提高肝硬化腹水大鼠水通道蛋白AQP9基因及蛋白的表达。6.健脾活血祛湿方能引起肝线粒体细胞色素C氧化酶活性、ATP含量、ATP酶活性的表达升高。7.健脾活血祛湿方兼具健脾补气、活血化瘀、清热除湿、理气和胃之功,可明显改善肝硬化腹水大鼠症状,消退腹水；能提高肝硬化腹水大鼠水通道蛋白AQP8、AQP9表达,减轻肝细胞、线粒体水肿,并能改善肝硬化腹水大鼠线粒体能量代谢障碍,从而以利于腹水消退。肝AQP8、AQP9与肝线粒体能量代谢之间可能有一定相关性。
【作者】李嘉；
【导师】刘友章；
【作者基本信息】广州中医药大学，中医内科学，2014，博士
【关键词】健脾活血祛湿方；肝硬化腹水；AQP8；AQP9；线粒体；细胞色素C氧化酶；ATP含量；ATP酶；

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