KLF4在肿瘤发生发展中的调控机制及功能研究

【摘要】S100蛋白是EF手相钙结合蛋白亚家族的成员,在多种肿瘤中表达异常,参与肿瘤发生发展的多个重要过程,并且与肿瘤的侵袭转移密切相关。S100A14是2002年发现的S100家族的新成员,我们前期研究发现胞外的S100A14蛋白可通过与细胞表面受体RAGE结合,激活MAPK信号通路,进而以RAGE依赖的方式调节食管癌细胞的增殖和凋亡；胞内研究表明S100家族成员S100A14可以p53依赖的方式调节MMP-2的表达进而影响细胞侵袭。进一步研究发现,S100A14和HER2共同表达于侵袭性的乳腺癌样本中,并作为HER2信号的一个调控因子,由此提供了它参与乳腺癌进程的证据,但是关于其上游调控机制知之甚少。我们经研究发现S100A14表达与乳腺癌分级和淋巴结转移呈正相关,与乳腺癌患者的预后呈负相关。进一步研究发现体外高表达S100A14或佛波酯处理均显著促进乳腺癌细胞的迁移。我们通过RT-qPCR和Westernblotting实验验证佛波酯显著诱导S100A14表达上调。此外,我们发现佛波酯对S100A14的调节需要其他调控因子的参与。计算机辅助转录因子结合位点分析发现S100A14启动子区域有两个保守的KLF4反式激活结合位点。KLF4是近年来发现的一种锌指转录因子,它是Spl/Kruppel样锌指转录因子家族的成员之一,参与调控细胞增殖、分化、胚胎发育等重要生命过程,并与肿瘤等多种疾病有关。目前尚未有直接证据表明KLF4是S100A14的上游转录调控因子,因此我们采用双荧光素酶报告基因实验以及染色质免疫共沉淀实验证实：佛波酯可促使KLF4直接结合到S100A14启动子保守结合位点,进而转录激活S100A14的表达。此外,我们经研究证实稳定敲降KLF4可显著削弱佛波酯对于S100A14的调控效应,降低佛波酯介导的乳腺癌细胞迁移。分析NCBI上已发表的GEO数据库中的基因表达谱,我们发现在人类乳腺癌中S100A14的表达水平与KLF4的表达水平显著相关,且证实了KLF4/S100A14与病人的预后呈负相关。综上所述,我们的研究结果表明,佛波酯诱导S100A14的表达进而促进乳腺癌细胞迁移,S100A14为KLF4下游功能靶基因,佛波酯通过KLF4依赖的方式调控S100A14的表达,由此促进乳腺癌细胞迁移,且证实了KLF4/S100A14与病人的预后成负相关。本研究增加了我们对KLF4/S100A14在乳腺癌进展中作用的认识,阐明了KLF4/S100A14之间的调控机制,为KLF4/S100A14作为乳腺癌病人预后指标提供了理论依据。过氧化物酶增殖体激活受体(PPARs)属核受体超家族,共有三种亚型(PPARa、PPARβ和PPARγ)。在PPARs的三种亚型中,研究得最为广泛的是PPARy,其与脂肪形成、免疫应答以及脂质和糖类代谢等多种生理过程密切相关。近年来,许多研究发现,PPARy可以抑制细胞周期、促进细胞分化、诱导细胞凋亡和抑制血管形成,从而具有抗肿瘤的生物效应。已有多篇文献报道,PPARy在与配体激动剂结合活化后,可以快速诱导KLF4表达水平上升,促进其下游细胞周期相关蛋白的表达,进而发挥其抑制细胞增殖、促进细胞分化和诱导细胞凋亡的功能。然而,以上研究并未在KLF4启动子区发现PPARγ的直接结合位点,那么KLF4是否为PPARγ的直接靶基因尚有待证实。因此,完善对PPARγ信号转导通路的认识,将为PPARγ激动剂在肿瘤治疗中的应用提供新的思路和线索。KLF4是近年来发现的一种锌指转录因子,它是spl/Kruppel样锌指转录因子家族的成员之一,参与调控细胞增殖、分化及胚胎发育等重要生命过程,并与肿瘤等多种疾病有关。首先,我们验证了PPARy激动剂在结直肠癌诱导细胞周期阻滞、抑制细胞增殖等抗肿瘤的作用。随后,机制研究发现,PPARγ通过直接结合KLF4启动子区PPAR反应元件(PPRE)调控KLF4的表达。进一步研究发现PPRE定位在KLF4ATG密码子的上游-1657bp至-1669bp,是曲格列酮(troglitazone,TGZ)诱导PPARγ转录激活KLF4表达的必要条件。最后,功能研究发现,稳定敲降KLF4可明显抑制PPARγ配体诱导的细胞周期阻滞和抗增殖效应。分析NCBI上已发表的GEO数据库中的基因表达谱,我们发现在结直肠癌中KLF4的表达水平与PPARγ的表达水平显著相关,且证实了PPARγ调控KLF4信号通路与结直肠癌病人的预后相关。综上所述,本研究验证PPARγ激动剂在结直肠癌中的抗肿瘤作用；并在分子水平证明KLF4为PPARγ蛋白调控的下游靶基因；PPARγ特异地结合KLF4启动子的PPRE反应元件,转录激活KLF4的表达,进而在细胞周期阻滞中担任重要角色；且证实了PPARγ调控KLF4信号通路与结直肠癌病人的预后呈负相关。以上研究结果完善了对PPARγ信号转导通路的认识,并为PPARγ激动剂在肿瘤治疗中的应用提供新的思路和线索。
【作者】李生；
【导师】刘芝华；
【作者基本信息】北京协和医学院，细胞生物学，2014，博士
【关键词】S100A14；乳腺癌；转移；KLF4；佛波酯；过氧化物酶增殖体激活受体；PPRE；TGZ；G1/S阻滞；

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