药物提高骨髓间充质干细胞治疗急性心肌梗死效果的实验研究

【摘要】目的：随着干细胞再生医学不断发展,应用骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)进行急性心肌梗死(acutemyocardialinfarction,AMI)后心肌修复成为一种有前景的方法。然而干细胞移植进行梗死心肌修复虽然有效,但是疗效有限。其疗效底下的原因之一是干细胞归巢至梗死心肌的数量较少。基质细胞衍生因子1(stromalcell-derivedfactor-1,SDF-1)与其特异性受体趋化因子受体4(CXCchemokinereceptor4,CXCIR4)构成的SDF-1/CXCR4生物学轴在MSCs归巢、定植到损伤部位参与修复的过程中发挥重要作用。既往研究表明,他汀不但能改善梗死微环境促进MSCs存活,而且能增强MSCs的自身抗凋亡能力。然而,他汀能否促进MSCs的迁移和归巢能力尚无相关研究。因此,我们进行此项研究,拟明确阿托伐他汀(atorvastatin,ATV)预处理能否增加MSCs表面CXCR4的表达,并提高MSCs的归巢能力,进而改善心梗后心功能。方法：实验分为体外实验和体内实验两部分。体外实验部分：分离并培养Sprague-Dawley大鼠MSCs,将第3代细胞随机分为正常对照组、ATV不同浓度梯度组(0.01μM、0.1μM、1μM、10μM)、ATV不同时间梯度组(1h、3h、6h、12h、24h、36h、48h)；机制探讨部分设MSCs组、最适ATV预处理组(ATV-MSCs).MSCs+CXCR4中和抗体组(MSCs-NA)、ATV-MSCs+CXCR4中和抗体组(ATV-MSCs-NA)。流式细胞术和RT-PCR检测各组CXCR4的表达,Transwell小室评估MSCs的迁移能力。体内实验部分：共108只雌性SD大鼠(6-8周龄),随机分为SDF-1动态测定组(AMI30min、1h、12h、24h、48h、72h、5d、7d)、假手术组(Sham)、心梗对照组AMI)、MSCs移植组(MSCs)、ATV预处理MSCs移植组(ATV-MSCs).采用结扎冠状动脉前降支的方法制作急性心肌梗死模型,梗死后24小时经尾静脉注射MSCs或ATV-MSCs(2×106细胞/只),对照组动物注射等体积PBS。在干细胞移植后3天(基线)及30天(终点)分别行心脏超声检测、病理组织学及分子生物学检测。结果：体外实验表明,与正常对照组相比,ATV剂量依赖性的增加细胞表面CXCR4表达,以1μMATV处理组最为明显(14.76±3.05%vs.1.98±0.40%,P<0.001)；与正常对照组相比,ATV处理组CXCR4的表达呈一定的时间依赖性,其中ATV处理12小时CXCR4的表达至峰值(22.77±2.03%vs.2.20±0.18%,P<0.001),24小时仍保持在较高水平(20.34±4.13%vs.2.20±0.18%,P<0.001)。CXCR4mRNA的表达趋势与细胞表面CXCR4的表达趋势相似。‘Transwell迁移结果显示,ATV预处理组MSCs向SDF-1迁移的数量是未处理组的2倍左右(24.65±5.57vs.12.70±2.40,P<0.001),然而加入CXCR4的中和抗体后MSCs的迁移能力被抑制。体内试验发现,干细胞移植后3天,冰冻切片激光共聚焦显微镜下观察到ATV-MSCs组归巢到梗死心肌区域的细胞数明显高于MSCs组(41.68±10.80vs.65.30±13.37,P<0.05),在非梗死区域未发现移植的干细胞；在细胞移植后30天,ATV-MSCs组和MSCs组的存活率都很低,MSCs组的存活率更低。与AMI组相比,MSCs组的左室收缩末期内径和左室射血分数有适度改善。与MSCs组相比,ATV-MSCs组的左室舒张末期内径和左室收缩末期内径进一步减小,左室射血分数(62.28±3.27%vs.52.77±7.05%,P=0.014)和左室短轴缩短率(27.80±2.16%vs.22.27±3.84%,P=0.015)显著改善。组织学分析显示,与AMI组和MSCs组相比,ATV-MSCs组的心肌纤维化面积显著减小,炎细胞浸润明显减轻。Westernblot分析显示,细胞移植后3天,ATV-MSCs组IL-6和TNF-α的表达水平明显降低；细胞移植后30天,其表达水平进一步降低。结论：ATV预处理可以提高MSCs表面CXCR4的表达,进而增强MSCs的迁移和归巢能力,并通过改善梗死心肌中炎性因子的表达,进一步改善心肌梗死后心功能,ATV预处理MSCs可能成为提高干细胞移植疗效的一有效方法。目的：骨髓来源的间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是移植治疗急性心肌梗死的理想种子。目前移植的瓶颈问题是移植后的干细胞在心梗后恶劣的微环境大量凋亡,导致其疗效受限。通心络是一种传统中药,在我国广泛应用于心血管疾病的治疗。我们既往的体内研究表明,中药通心络可以增加MSCs的存活,提高干细胞移植疗效,但是通心络在能否减少MSCs的凋亡及其具体机制尚未明确。单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase,AMPK)是调控细胞能量代谢的核心分子,内皮型一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase,eNOS)是AMPK下游的重要分子,AMPK/eNOS通路在调节细胞凋亡中发挥重要作用。因此我们在体外建立缺氧无血清(hypoxiaandserumdeprivationH/SD)模型来模拟心肌梗死后体内缺血缺氧环境,探讨通心络(tongxinluo,TXL)能否减少MSCs的凋亡,并明确AMPK/eNOS通路在其中发挥的作用。方法：分离并培养Sprague-Dawley大鼠MSCs,将第3代细胞随机分为正常对照组、H/SD对照组、通心络不同浓度梯度组(50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL)、AMPK通路抑制剂CompoundC组(10μM)。在荧光显微镜下观察Hocchst33342染色阳性细胞以及TUNEL染色阳性细胞,AnnexinV/PI流式细胞术检测各组细胞的凋亡比例,荧光探针JC-1流式细胞术检测线粒体膜电位的变化,并进一步采用westernblot方法检测凋亡相关蛋白细胞色素C、bax、bcl-2水平及AMPK、eNOS及其磷酸化蛋白的水平。结果：与正常组相比,H/SD条件下细胞凋亡明显增加AnnexinV+/PI-细胞：21.91±3.28%vs.2.13±0.33%,P<0.001；JC-1红/绿色荧光比值：5.40±0.43vs.2.34±0.25,P<0.001)。通心络剂量依赖性的降低MSCs凋亡,在400μg/mL浓度时最为明显,表现为nnexinV+/PI-细胞减少(3.47±0.69%vs.21.91±3.28%,P<0.001),JC-1红/绿色荧光比值增高(4.78±0.37vs.2.34±0.25,P<0.001),促凋亡蛋白bax表达降低(1.06±0.24vs.2.92±0.29,P<0.001),抗凋亡蛋白bcl-2表达增高(2.59±0.15vs.1.14±0.09,P<0.001)。而且,通心络各组AMPK和eNOS的磷酸化水平显著升高。加入AMPK抑制剂CompoundC后通心络组AMPK和eNOS的磷酸化水平下降,同时减弱了通心络的抗凋亡作用。结论：通心络可以抑制缺氧无血清培养条件下诱导的MSCs凋亡,其中AMPK/eNOS通路在其中发挥重要作用。这也为通心络在心血管系统中的多效性提供了新的解释。通心络可能成为提高心肌梗死患者MSCs存活的又一有效方法。
【作者】李娜；
【导师】杨跃进；
【作者基本信息】北京协和医学院，内科学，2014，博士
【关键词】急性心肌梗死；阿托伐他汀；间充质干细胞；细胞迁移；CXCR4；通心络；凋亡；信号通路；

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